非標的質量分析法 - 嘉興ガラスシーリング有限公司

npj 食の科学第 7 巻、記事番号: 21 (2023) この記事を引用

1356 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

プロバイオティクスの機能性製品は人気が高まっているため、広く注目を集めています。しかし、発酵プロセスにおけるプロバイオティクス特有の代謝を分析した研究はほとんどありません。この研究では、UPLC-QE-MS ベースのメタボロミクスを適用して、2 つのプロバイオティクス株、Lacticaseibacillus paracasei PC-01 と Bifidobacterium adolescentis B8589 による発酵過程における乳メタボロームの変化を追跡しました。発酵の0時間から36時間の間でプロバイオティクス発酵乳のメタボロームに大きな変化が観察されましたが、中間期（36時間と60時間）と熟成段階（60時間と72時間）の乳メタボロームの違いはそれほど明白ではありませんでした。。主に有機酸、アミノ酸、脂肪酸に属する、時点特異的な多数の示差的代謝産物が同定されました。同定された示差的代謝産物のうち 9 つは、トリカルボン酸回路、グルタミン酸代謝、および脂肪酸代謝に関連しています。ピルビン酸、γ-アミノ酪酸、カプリン酸の含有量は発酵の最後に増加し、プロバイオティクス発酵乳の栄養品質と機能的特性に寄与する可能性があります。この経時的メタボロミクス研究では、乳中のプロバイオティクスに特有の発酵変化を分析し、乳マトリックス中のプロバイオティクスの代謝とプロバイオティクス発酵乳の潜在的な有益なメカニズムに関する詳細な情報を提供しました。

発酵は代謝プロセスであり、酵素の作用により有機物が完全に分解されます1。発酵乳は最も重要な発酵食品の 1 つであり、健康食品およびプロバイオティクスの優れた担体として認識されています2。プロバイオティクスは、腸管、口腔、女性の生殖管、さらには皮膚粘膜層にまで広く分布しています。発酵乳へのプロバイオティクスの介入は、世界中の医師、特に消化器科医によって主に支持されています3。プロバイオティクス発酵乳が、血清コレステロールの低下、免疫反応の促進、腸の健康の改善、さまざまながんの予防、認知障害の軽減など、さまざまな健康上の利点を消費者にもたらすという証拠が増えています2。これらの効果は、ペプチド、多糖類、脂肪酸、有機酸、ビタミン、γ-アミノ酪酸 (GABA)4 など、プロバイオティクス発酵乳に含まれるさまざまな機能性成分に起因すると考えられます。 Lacticaseibacillus paracasei は、その健康への影響により、プロバイオティクス食品業界で広く使用されています。健康強調表示は胃腸の健康だけでなく宿主免疫にも及んでおり、最近の科学的証拠は歯周炎や虫歯などの口腔疾患の軽減に対する臨床効果を裏付けています5,6。さらに重要なことは、一部のラティカセイバチルスパラカゼイ株は優れた発酵特性を備えており、食品発酵に使用できることです6,7。有益な細菌の別のグループはビフィズス菌です。 Bifidobacterium adolescentis 種は、健康な体重の維持 8 や便秘の予防 9 など、宿主の健康に関連する人間の腸内細菌叢の重要な構成要素であるため、ますます注目を集めています。しかし、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスは生存率が低いため、発酵に使用するのが困難です10。したがって、ビフィドバクテリウム・アドルセンティスを、発酵性能の良い他の菌株と複合発酵させることは、プロバイオティクスとしての生存率を高める 1 つの選択肢となるでしょう。

これまでのいくつかの研究では、プロバイオティクス発酵乳のメタボロームの変化を調査しましたが、ほとんどの研究は、その過程におけるプロバイオティクス特有の機能と代謝の分析に焦点を当てていません1,11。 Streptococcus Thermophilus および Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクスは、プロバイオティクス乳発酵を生成するためにプロバイオティクスと組み合わせて使用される最も一般的な基本的なスターター細菌です10。しかし、これらの伝統的なスターター細菌を発酵においてプロバイオティクスと組み合わせて使用すると、プロバイオティクス特有の生化学的効果および代謝を従来のスターター細菌のものと区別することが困難になります。したがって、乳メタボロームに対するプロバイオティクスの単一の効果を調査することは興味深いことであり、それによってプロバイオティクス特有の代謝についての洞察が得られるでしょう。さらに、発酵が終了した後でも、生存微生物の継続的な生理学的作用により、プロバイオティクス製品の乳メタボロームの熟成変化が発生する可能性があります。発酵中および発酵後のプロバイオティクス細菌の高い生存率がその有益な効果にとって重要であるため、これはプロバイオティクス製品において特に重要です。しかし、以前の研究は通常、製品の品質と安定性も反映する乳発酵プロセス中の代謝物の変化のモニタリングに焦点を当てずに、熟成の変化のみを分析しています11,12。

この研究では、乳発酵に 2 つのプロバイオティクス菌株、すなわち、Lacticaseibacillus paracasei PC-01 (PC-01) と Bifidobacterium adolescentis B8589 (B8589) を適用しました。 PC-01株は、自然発酵したヤク乳から分離されました。優れた発酵性とプロバイオティクスの特性により、発酵乳の生産に応用され成功しています13。 B8589 株は健康な乳児の腸から分離されました。また、優れた抗炎症効果と腸内微生物叢の調節効果もあります14。さらに、我々の以前の研究では、乳発酵における PC-01 と B8589 の併用により、PC-01 株を単独で使用した場合と比較して、製造された発酵乳中の GABA および短鎖脂肪酸のレベルが大幅に増加することが判明しました。プロバイオティクス機能13. したがって、この研究は、両方の菌株を乳製品スターターとして一緒に使用した場合の、共発酵および発酵乳の熟成プロセス中の乳の代謝学的変化をさらに調査することを目的としました。生菌数と乳のメタボロミクスの変化は、それぞれフローサイトメーターとノンターゲットメタボロミクスでモニタリングされました（図1）。

低温殺菌牛乳は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス B8589 とラクティカセイバチルス・パラカゼイ PC-01 の 2 つのプロバイオティクス株によって共発酵されました。 72 時間後に pH が 3.8 に達するまで、発酵の 12 時間ごとにサンプルを収集しました。発酵乳中のプロバイオティクス生菌数をフローサイトメトリーによって数えました。牛乳の発酵過程における対象となる代謝産物および代謝経路の変化を追跡するために、牛乳のメタボローム (0、36、60、および 72 時間) が超高性能液体クロマトグラフィーによって検出されました。最後に、特定された異なる代謝経路に対して濃縮分析が実行されました。

プロバイオティクス発酵乳の生細胞数は、フローサイトメトリーを使用して発酵のさまざまな時点で検出されました (図 2A)。生菌数は発酵 36 時間でピーク (1.57 × 1010 CFU/mL) に達し、発酵 0 時間 (8.49 × 107 CFU/mL; P < 0.001) よりも有意に高かった。 60 時間では 8.87 × 109 CFU/mL に大幅に減少し (P < 0.001)、72 時間では 1.57 × 1010 CFU/mL に上昇しました (P < 0.001)。

A プロバイオティクス発酵乳中の生菌数の変化。エラーバーは平均値 ± SD を表します。 ***P < 0.001。時点間の微生物生菌数の差は、95% 有意水準 (P < 0.05) で ANOVA を使用して評価されました。 B 発酵のさまざまな時点、つまり 0、36、60、および 72 時間での乳メタボロームの主成分分析スコアプロット。 QC品質管理サンプル。

非ターゲットメタボロミクス (UPLC-QE-MS に基づく) を、0、36、60、および 72 時間の時点で収集したプロバイオティクス発酵乳サンプルに対して実行しました。解釈可能性を向上させ、データを検証するために、主成分分析と直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) を実行して、さまざまな時点での乳メタボロームの変化を視覚化しました。主成分分析は、サンプル間の全体的な変動を反映する教師なし機械学習アルゴリズムです。 x 軸と y 軸はそれぞれ、第 1 および第 2 主成分で構成される平面上のサンプルの投影スコアを示し、サンプル間の類似性または差異の参照を提供できます。 0、36、60、および 72 時間のサンプルを表すシンボルは、明確な時間ベースのクラスター化傾向を示し、品質管理サンプルもグループとして密接にクラスター化しており (図 2B)、乳メタボロームの全体構造が時間ごとに変化していることを示唆しています。点、および装置とクロマトグラフィーの条件が安定していて信頼できるものであることを確認しました。

次に、OPLS-DA モデルを使用して、時点間 (0 時間対 36 時間、36 時間対 60 時間、60 時間対 72 時間) の差次的なマーカー代謝物を特定しました。 OPLS-DA モデリングは教師あり分類に基づいています。代謝物のカテゴリ変数に関連しない直交変数をフィルターで除外し、非直交変数と直交変数を個別に分析して、グループ間のより信頼性の高い差分代謝物を取得します。 OPLS-DA モデルのスコアプロットを図 3A ～ C に示します。ここでも、各ペア比較で明確な時間ベースのクラスタリング傾向が観察されます。さらに、各グループのモデルパラメーターにより、モデルの有効性と精度が確認されました (0 時間対 36 時間: R2Y = 0.999、Q2 = 0.997; 36 時間対 60 時間: R2Y = 0.992、Q2 = 0.983; 60 時間対 72 h: R2Y = 0.994、Q2 = 0.988)。

発酵乳サンプルの A ～ C 直交部分最小二乗判別分析スコアプロットと D ～ F 火山プロット。 A、D 0 時間対 36 時間。 B、E 36 時間対 60 時間。 C、F 60 時間と 72 時間。火山プロットは牛乳のメタボロミクスデータを示しています。各ドットは検出された代謝産物を表します。サンプル間のペアワイズ比較によって見つかった代謝産物の有意な増加 (Sig_Up) と減少 (Sig_Down) は、それぞれ赤と青で示されます (カットオフ P < 0.05 および倍率変化 [FC] >2 または <0.5)。重要なしきい値は、火山プロット内の黒い点線でマークされています。時点間の差次的な代謝産物は、ANOVA を使用して 95% 有意水準 (P < 0.05) で評価されました。

検出された代謝物は火山プロットで視覚化され（図3D〜F）、示差マーカー代謝物のカットオフ閾値は変化倍数〜2または<0.05、およびP<0.05でした。合計 304 個の異なる代謝産物 (0 時間と比較して 36 時間で 151 個増加、153 個減少) が特定され、そのうち 244 個はデータベース検索によって特定されました (補足表 1)。これには、66 個の脂質および脂質様分子、59 個の有機酸、および誘導体、43 個の有機酸素化合物、31 個の有機複素環式化合物、13 個のフェニルプロパノイドおよびポリケチド、15 個のベンゼノイド、および 17 個の他の代謝産物。 36 時間と 60 時間のプロバイオティクス乳代謝物の間で 111 個の差次的代謝物が同定され (36 時間と比較して 60 時間では 43 個が増加し、67 個が減少)、これらの差次的代謝物のうち 79 個がデータベース検索によって特定されました (補足表 1)。これには、21 種類の有機酸素化合物、20 種類の有機酸および有機誘導体、17 種類の有機複素環式化合物、9 種類の脂質および脂質様分子、および 12 種類の他の代謝産物が含まれます。 60 時間から 72 時間の間に 36 個の差次的代謝物が同定され（60 時間と比較して 72 時間では 24 個増加、12 個減少）、これらの差次的代謝物のうち 27 個がデータベース検索によって特定されました（補足表 1）。これには 7 つの脂質と脂質が含まれます。様分子、9 つの有機酸素化合物、5 つの有機酸と誘導体、および 6 つの他の代謝産物。

次に、プロバイオティック発酵乳生産における生化学プロセスをさらに理解するために、主要な示差代謝産物を化学的性質別にランク付けしました (図 4)。差次的代謝産物の主な 4 種類は、脂質および脂質様分子、有機酸および誘導体、有機酸素化合物、有機複素環式化合物に属し、次にフェニルプロパノイドおよびポリケチド、ベンゼノイド、アルカロイドおよび誘導体などが続きました。明らかに、時点間で異なる代謝プロファイル（代謝物の多様性と存在量の両方）が見られました（0時間対36時間、36時間対60時間、60時間対72時間）。乳発酵のさまざまな段階における生化学的変化をさらに調査するために、我々は 3 つの主要なタイプの代謝産物 (すなわち、脂質および脂質様分子、有機酸およびその誘導体、有機酸素化合物) に対して代謝経路濃縮分析を選択的に実行しました。

ピンク、緑、青の水平バーは、0 時間から 36 時間の間に特定された示差的代謝産物の数 (バーの横/上に書かれている) を表します。 36時間と60時間。それぞれ60時間と72時間。

代謝物経路濃縮分析は、サンプルの代謝変化のメカニズムを解明するための効果的なツールです。 0 から 36 時間までに、17 の異なる代謝産物 (主にアミノ酸と有機酸; 図 5A および補足表 2) を含む、25 の有機酸および誘導体関連の代謝経路が同定されました。 9 つの異なる代謝産物 (主に脂肪酸とグリセロリン脂質; 図 5B および補足表 2) を含む、10 の脂質および脂質様分子関連の代謝経路が濃縮されました。 13 の異なる代謝産物 (主に炭水化物、図 5C および補足表 2) が関与する、10 の有機酸素化合物関連代謝経路が特定されました。

(A-C) 0 時間と 36 時間の比較。 D ～ F 36 時間および 60 時間。および G-I 60 時間および 72 時間。豊富な経路は、それぞれ有機酸および有機誘導体 (A、D、G)、脂質および脂質様分子 (B、E、H)、および有機酸素化合物 (C、F、I) に関連しています。カラースケールは、サンプルのペア間の有意差の信頼度 (P 値) を表します。示差的な代謝経路は、Wilcoxon 順位和検定によって検出されました。

36 時間から 60 時間までに、6 つの異なる (主にアミノ酸と有機酸; 図 5D および補足表 2) を含む、17 の有機酸および誘導体関連代謝経路が同定されました。 2 つの異なるグリセロリン脂質代謝産物を含む、3 つの脂質および脂質様分子関連の代謝経路が濃縮されました (図 5E および補足表 2)。 7 つの異なる代謝産物 (主に炭水化物、図 5F および補足表 2) を含む、7 つの有機酸素化合物関連代謝経路が特定されました。

60 から 72 時間までに、1 つの有機酸を含む 2 つの有機酸および誘導体関連代謝経路が特定されました (図 5G および補足表 2)。 2 つの脂質および脂質様分子に関連する代謝経路が強化され、2 つの異なる代謝産物 (主に脂肪酸と胆汁酸、図 5H および補足表 2) が関与しました。 5 つの異なる代謝産物 (主に糖、カルボニル化合物、アルコール; 図 5I および補足表 2) を含む、6 つの有機酸素化合物関連代謝経路が特定されました。

この研究では、LC-MS ベースのメタボロミクスを使用して、細菌株 PC-01 および B8589 による複雑な発酵中のさまざまな時点でのプロバイオティクス乳メタボロームの代謝変化を調査しました。異なる時点での代謝産物を比較することにより、いくつかの重要な異なるバイオマーカーが同定されました。これらの代謝産物は主に有機酸、アミノ酸、脂肪酸であり、トリカルボン酸（TCA）回路、脂肪酸代謝、グルタミン酸代謝などの重要な代謝経路に関与しています（図6）。これらの代謝産物とそれらが関与する代謝経路は、牛乳環境におけるプロバイオティクス細菌の成長と繁殖に影響を与えるだけでなく、発酵乳の風味とプロバイオティクス特性にも影響を与えます。代謝経路は複雑で、各経路は生成された代謝産物のフィードバック機構を介して相互に促進または阻害する可能性があります。我々の知る限り、現在発見されている代謝産物の相互作用とそれに関連する乳発酵における代謝経路/特異的効果はこれまで報告されておらず、さらなる研究が必要である。発酵段階に特有の 9 つの代謝産物 (コハク酸、ピルビン酸、l-グルタミン酸、フマル酸、GABA、カプリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸) が、差次的に濃縮された代謝に大きく寄与しました (図 6)。これらの代謝産物は発酵乳中に遍在しており、その品質と感覚特性にとって重要です。

9 つの代謝物 (ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、l-グルタミン酸、GABA、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、カプリン酸) は代謝マップ (左パネル) に黒で書かれています。水平棒グラフ (右パネル) は、さまざまなサンプル収集時点、つまり 0、36、60、および 72 時間におけるこれらの代謝産物の相対存在量を示しています。 CoA コエンザイム A、GABA γ-アミノ酪酸、TCA トリカルボン酸。

差次的代謝産物のほとんどは有機酸です。最も一般的な有機酸はカルボン酸 (R-COOH) であり、その酸性はカルボキシル基 (-COOH) に由来します。短鎖カルボン酸は、乳製品の風味に影響を与える重要な化学要素です。これらの酸は、脂肪分解、炭水化物代謝、およびアミノ酸代謝に由来します15。この研究で見つかったバイオマーカーの短鎖カルボン酸には、乳酸菌の代謝で生成されるコハク酸、ピルビン酸、フマル酸が含まれます7、16、17。

ピルビン酸は、ヘキソキナーゼによるグルコースのリン酸化後に生成されるグルコース 6-リン酸を分解することによって生成されます18。これは解糖の最終生成物であり、ヨーグルトに酢酸の香りと心地よい酸味を与えます。この研究では、この発酵段階でプロバイオティクスの急速な増殖を伴う、0 時間から 36 時間までのピルビン酸塩の大幅な増加が見られました。細菌の急速な増殖は、初期のグルコースが豊富な環境と異化作用よりもピルビン酸同化作用の方が高いためと考えられます。発酵が終了すると、グルコースが枯渇し、より多くのピルビン酸が他の下流代謝産物に変換され、細菌の増殖が遅くなります。ピルビン酸は、TCA サイクルの重要な基質であるアセチル CoA の前駆体でもあります 15。コハク酸とフマル酸は、TCA サイクルの中間体です。酸味、塩味、苦味のあるコハク酸は、細胞の酸化ストレスと炎症反応を調節するミトコンドリアシグナル伝達分子の 1 つです19。フマル酸は、フルーティーな酸味を持つ自然界で最も単純な不飽和ジカルボン酸です20。コハク酸は、コハク酸デヒドロゲナーゼによってフマル酸に酸化されます19。ピルビン酸と同様に、この研究では 36 時間でコハク酸が大幅に増加することがわかりました。しかしながら、フマル酸の含有量は減少し続け、コハク酸の蓄積とともに増加することはなかった。これは、プロバイオティクス細菌がフマル酸を消費したことを示唆している可能性があります。一部の乳酸菌（リモシラクトバチルス・ロイテリやラティカセイバチルス・カゼイなど）は、TCAサイクルを還元反応の方向、つまりフマル酸を還元してコハク酸を形成して細菌の増殖を促進する方向に利用できます21。さらに、フマル酸塩は通常の代謝中に過剰に蓄積することはなく、フマル酸ヒドラターゼによってすぐに触媒されてリンゴ酸塩が生成されます22。確かに、差次的代謝産物として D-リンゴ酸が検出されましたが、0 時間と比較して 36 時間では有意な増加はありませんでした。これがフマル酸の継続的な減少のもう一つの理由である可能性があります。

アミノ酸の代謝はTCAサイクルと密接に関係しており、アミノ酸は窒素源代謝の重要な産物でもあります。 l-グルタミン酸とα-ケトグルタル酸は、GABA 代謝経路を通じてアミノ酸代謝と TCA サイクルを結びつけます23。 GABA の代謝経路は TCA サイクルから派生した分岐であり、微生物がグルタミン酸デカルボキシラーゼを通じて L-グルタミン酸を直接かつ不可逆的に脱炭酸して GABA24 を合成するプロセスです。 GABA は炭素数 4 の非タンパク質アミノ酸で、血圧降下、抗けいれん作用、神経の鎮静、肝臓と腎臓の改善、体の抗酸化能力の強化、運動耐性の向上、免疫機能と生殖能力の強化など、さまざまな機能があります25。。発酵経路の 1 つは微生物によるグルタミン酸の GABA への変換であり、これは発酵中の pH の低下によって引き起こされます 26。私たちの結果は、GABA 含有量が継続的に増加し、発酵の終わりにピークに達し、発酵乳の酸性化と相関していることを示しました。同時に、GABA は一部の細菌の増殖因子でもあり、一部の発酵システムではプロバイオティクスの増殖を促進することが報告されています24。これは、プロバイオティクスの高い生存率による活発な細菌の増殖に関する現在の観察と一致しています。一方、グルタミン酸は高濃度で塩味を与え27、発酵によるグルタミン酸のGABAへの変換によりプロバイオティクス発酵乳の感覚的な品質が向上します。

脂肪酸は通常、脂肪分解、タンパク質の加水分解、乳糖発酵などの化学プロセスによって生成されます。そして脂肪酸代謝は、基質であるアセチルCoA11を介してTCAサイクルに関係しています。脂肪酸は、製品の味、風味、食感を改善するだけでなく、消費者に生理学的影響も与えます。主な不飽和脂肪酸はオレイン酸で、発酵乳中の全不飽和脂肪酸の 70% を占めます28。オレイン酸は血中脂質を調節し、コレステロールを低下させ、インスリン感受性を改善します。また、重症患者の酸化ストレスや過剰な炎症反応を軽減することもできます29。いくつかの研究では、発酵中の乳製品中のオレイン酸の減少が検出されており 11,30 、これは私たちの結果と一致しています。私たちの研究では、36 時間の発酵後にオレイン酸の含有量が大幅に減少することがわかりました。これは、水素化によるオレイン酸のステアリン酸への変換によって説明される可能性があります 11。実際、36 時間後にステアリン酸の増加が観察されました。疫学研究では、さまざまな脂肪酸の摂取が異なる生物学的影響を与えることがわかっています 31。ステアリン酸レベルの上昇は、血圧の低下、心機能の改善、がんリスクの軽減と関連しています32。飽和脂肪酸は有害であるという一般的な考えに反して、ステアリン酸は人間の健康に有益な効果があるようですが、この現象の分子機構はまだ不明です 31,33。発酵乳で検出されるもう 1 つの一般的な脂肪酸はパルミチン酸ですが、これは一般に不健康であると考えられています 34。しかし、ほとんどの研究は高用量のパルミチン酸の効果を分析しただけであり 32,35、プロバイオティクス発酵乳中のパルミチン酸の望ましいアポトーシス効果と抗がん効果を実証した研究は 1 つだけです 36。乳製品はパルミチン酸とステアリン酸の重要な食事源ですが、その摂取は心代謝性疾患のリスク低下と関連しています37。したがって、乳発酵によるパルミチン酸とステアリン酸の増加は望ましい可能性がありますが、これらの代謝産物の健康への影響を確認するにはさらなる研究が必要です。私たちの結果は、カプリン酸のレベルが発酵の 36 時間で顕著に増加し、発酵の終了まで高いレベルを維持することを示しました。カプリン酸は、一部の発酵乳に含まれる中鎖脂肪酸で、てんかんを改善し、脳のエネルギー代謝を促進し、栄養吸収不良症候群を軽減します38。

結論として、この研究では、UPLC-QE-MS を使用して、乳発酵中および発酵後のさまざまな時点での細菌の生存率とプロバイオティクス発酵乳メタボロームのスナップショットを生成しました。プロバイオティクス発酵乳のメタボロームは、初期の時点 (0 ～ 36 時間の間) では大きく変化しましたが、中間期間 (36 ～ 60 時間の間) と熟成期間 (60 ～ 72 時間の間) ではわずかな差しか示さなかった。プロバイオティクス乳発酵のさまざまな段階間で、TCA サイクル、グルタミン酸代謝、脂肪酸代謝に関与する、主に有機酸、アミノ酸、脂肪酸を含む多くの異なる代謝産物が同定されました。 9 つの異なる代謝物が時点特異的な異なるバイオマーカーとして同定され、それらの変化がプロバイオティクス発酵乳の独特の感覚的および栄養的品質につながる可能性があります。ピルビン酸、GABA、カプリン酸などの一部の機能性生体分子は、発酵の終わりに大幅に増加し、プロバイオティクス発酵乳の有益な特性に寄与している可能性があります。この経時的メタボロミクス研究では、乳中のプロバイオティクスに特有の発酵変化を分析し、乳マトリックス中のプロバイオティクスの代謝に関する詳細な情報を提供しました。

2% グルコースを含む脱脂粉乳 (NZMP、ウェリントン、ニュージーランド) を蒸留水に溶解しました (50 °C、30 分)。牛乳を均質化し（65 °C、20 MPa）、低温殺菌（95 °C、5 分間）した後、20 °C に冷却しました。細菌株、B8589 および PC-01 を複合発酵に使用しました。両方の菌株は、中国の内モンゴル農業大学の乳酸菌培養コレクションから提供されたプロバイオティクスでした。プロバイオティクスを冷却した低温殺菌スキムミルクに接種し、初期生菌数を PC-01 では 1 × 107 CFU/mL、B8589 では 1 × 106 CFU/mL にそれぞれ調整しました。接種したミルクを、72 時間後に pH が 3.8 に達するまで、37 °C で嫌気的に発酵させました。 pH 3.8 に達した後、プロバイオティクス発酵乳はさらなる分析まで -80 °C で保存されました。発酵乳サンプルは、発酵プロセス中に 12 時間ごとに収集されました。研究デザインを図 1 に示します。

発酵乳中のプロバイオティクス細菌の生菌数は、前述のように数えられました 39。 2 つの染色剤、SYTO 9 (5 mM) およびヨウ化プロピジウム (PI; 1 mg/ml) をそれぞれ DMSO (≤ 1%) に溶解しました。発酵乳サンプルを 106 ～ 107 CFU/mL の密度に希釈し、希釈した発酵乳サンプル 980 μL を 4 本の清潔なチューブに移しました。 3 本のチューブに、10 μL PI (0.2 mM/L; PI 単一染色)、10 μL SYTO 9 (0.1 mM/L; SYTO 9 単一染色)、および 10 μL の混合染色 (SYTO 9、0.1 mM/L) ；PI 0.2 mM/L；二重染色）をそれぞれ加えた。 4 本の遠心分離管すべてを 30 秒間振盪し、室温、暗所で 15 分間インキュベートしました。二重染色サンプルのアリコート（各 200 μL）を、フローサイトメーター（MoFlo Astrios EQ Cell Sorter）での分析のために、等量の絶対計数用マイクロスフェア（フローカウンティング蛍光球; Beckman Coulter Inc.、ブレア、カリフォルニア州、米国）と混合しました。 ; Beckman Coulter Inc.、米国カリフォルニア州ブレア）。

フローサイトメーターの光源は空冷アルゴンイオンレーザー（励起光波長488nm、発光波長＞630nm）であった。各サンプルについて、500,000 個の細胞からデータが収集されました。未染色のサンプルとPI蛍光染色した細菌サンプルを対照として使用しました。前方散乱側散乱ドットプロットを描画し、標的細胞の輪郭を描くように R1 ゲートを設定しました。 488-513/26-Height-Logを横軸とし、561-614/20-Height-Logを縦軸とする散布図を確立して、SYTO 9陽性細菌およびPI陰性細菌の数を描写した。水平座標として 488-710/45-Height-Log、垂直座標として 488-SSC-Area を使用した散布図を設定して、微小球の絶対数を数えました。総細菌数＝生菌数／マイクロスフェアの絶対数×マイクロスフェア濃度の絶対数×希釈率。

サンプル（各100μL）をエッペンドルフチューブ内で400μLの抽出溶液（アセトニトリル：メタノール＝1：1、同位体標識内部標準混合物を含む）と30秒間混合した。混合物を氷水上で 10 分間超音波処理し、-4 °C で 1 時間放置し、4 °C、12,000 rpm (遠心力 13,800 × g、半径 8.6 cm) で 15 分間遠心分離しました。サンプル上清を濾過し、Q Exactive HF-X ハイブリッド四重極に接続した Acquity UPLC (Vanquish、Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用した超高性能液体クロマトグラフィー分析 (UPLC) 用に清潔なサンプルバイアルに移しました。 Orbitrap 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム)。 Acquity UPLC BEH Amide カラム (2.1 mm × 100 mm、1.7 μm) を分析物の分離に使用しました (Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード)。機器およびクロマトグラフィー条件の安定性を確保するために、すべてのサンプルを等量混合して実行する QC サンプルを合成しました。液体クロマトグラフィー相は以下の通りであった。水相Ａは、２５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウムおよび２５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニア水を含有する。相 B はアセトニトリルでした。勾配溶出は次のようにプログラムされました: 0 ～ 0.5 分、95% B。 0.5 ～ 7 分、95 ～ 65% B; 7 ～ 8 分、65 ～ 40% B。 8 ～ 9 分、40% B。 9 ～ 9.1 分、40 ～ 95% B。 9.1 ～ 12 分、95% B。サンプルパンの温度は 4 °C、注入量は 2 μL でした。 QE HFX 質量分析計は、取得ソフトウェア (Xcalibur、Thermo) の制御における情報依存取得 (IDA) モードで MS/MS スペクトルを取得する機能のために使用されました。このモードでは、取得ソフトウェアはフルスキャン MS スペクトルを継続的に評価します。エレクトロスプレーイオン化源の条件は次のように設定した。シースガス流量３．３５Ｌ／分。補助ガス流量16.8 L/分。キャピラリー温度は 350 °C。質量範囲は 70 ～ 1050。スキャン/サイクル時間は 760 ミリ秒。 60,000 のフル MS 解像度。 MS/MS 分解能 7500。正規化衝突エネルギーモードでの衝突エネルギーは 10/30/60。スプレー電圧はそれぞれ 3.6 kV (正イオンモード) または 3.2 kV (負イオンモード) です。

元のデータファイルは ProteoWizard ソフトウェアによって mzXML 形式に変換されました。自己作成の R パッケージ (XCMS カーネル) を使用して、ピークの同定、抽出、アライメント、および統合のためのデータを処理し、社内の MS2 データベース (BiotreeDB) を代謝物のアノテーションに使用しました。

時点間の微生物生菌数の差は、R バージョン 4.0.4 (R Foundation for Statistical Computing、ウィーン、オーストリア) を使用し、95% 有意水準 (P < 0.05) で ANOVA を使用して評価しました。時点間のメタボローム変化は、オンラインツール Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca) によって構築された主成分分析と OPLS-DA を使用して視覚化されました。検出された代謝産物はボルケーノプロットによって視覚化され、有意に異なる代謝特徴が倍率変化（倍率変化 >2 または <0.5）および P 値（P < 0.05）に従って選択されました。代謝経路のアノテーションと示差代謝産物の濃縮分析は、京都遺伝子・ゲノム百科事典データベース (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) を使用して実行されました。研究デザインの概略図は、オンラインツール BioRender (https://app.biorender.com/) によって作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

私たちは、この研究に関連するすべてのデータがこの論文とその補足情報に含まれていることを宣言します。

シェン、X.ら。メタボロミクス分析により、個々のラクトコッカスラクティス亜種間の乳代謝と発酵速度の違いが明らかになります。ラクティス株。食品研究所内部。 162、111920 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Saykandar, HA & Zhang, H. プロバイオティクス発酵乳とその in vivo 機能性の動向: 総説。トレンド食品科学テクノロジー。 110、55–65 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Suez, J.、Zmora, N.、Segal, E. & Elinav, E. プロバイオティクスの長所、短所、そして多くの未知数。ナット。医学。 25、716–729 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

de la Fuente, B.、Luz, C.、Puchol, C.、Meca, G. & Barba, FJ Lactobacillus brevis POM および Lactobacillus plantarum (TR-7、TR-71、TR-14) による発酵の評価オレンジジュースとミルクをベースにした飲料の抗酸化化合物と有機酸について。食品化学。 343、128414 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Patterson, E.、Griffin, SM、Ibarra, A.、Ellsiepen, E. & Hellhammer, J. Lacticaseibacillus paracasei Lpc-37(R) は、健康な成人のストレスと不安の心理的および生理学的マーカーを改善します: ランダム化二重盲検、プラセボ対照および並行臨床試験（Sisu 研究）。ニューロビオール。ストレス 13、100277 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、X.ら。ラクトチカセイバチルス・パラカゼイ・シロタ株を含む発酵乳がうつ病患者の便秘に及ぼす影響：ランダム化二重盲検プラセボ対照試験。栄養素 13、2238 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サン、Ｅら。ラクトバチルス・パラカゼイ LC-37 を含む飲料は、腸内微生物叢とその代謝産物の制御を通じて機能性消化不良を改善しました。 J. デイリーサイエンス 104、6389–6398 (2021a)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang、B.ら。さまざまな宿主から分離されたビフィドバクテリウム・アドレセンティスは、高脂肪食を与えられたマウスにおいて腸内細菌叢を改変し、異なる代謝特性および免疫調節特性を示します。栄養素 13、1017 (2021a)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン、L.ら。 Bifidobacterium adolescentis は、BALB/c マウスのロペラミドによって誘発される便秘に対して菌株特異的な効果を発揮します。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．知る 18、318 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、J.ら。単一のプロバイオティクス株であるラクトバチルス・カゼイ・チャンとビフィドバクテリウム・アニマリスssp.の効果の比較。ヨーグルトの揮発性および不揮発性メタボロームプロファイルに関するラクティスプロビオ-M8とその組み合わせ。 J. デイリーサイエンス 104、7509–7521 (2021b)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zha、M.ら。非標的質量分析ベースのメタボロミクスアプローチにより、ラクトバチルスプランタルム P9 によって発酵された牛乳の分子変化が明らかになります。 Lwt 140、110759 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Guo, S. et al. ガスクロマトグラフィーイオン移動度分光法による揮発性代謝物の代謝フットプリント分析。ストレプトコッカス・サーモフィラス乳発酵中の異なる発酵温度を識別します。 J. デイリーサイエンス 104、8541–8553 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サン、Ｙら。ビフィドバクテリウム・アドレセンティス B8589 とラティカセイバチルス・パラカゼイ PC-01 の共発酵乳には、ラティカセイバチルス・パラカゼイ PC-01 発酵乳よりも多くのγ-アミノ酪酸と短鎖脂肪酸が含まれています。 Lwt 179、114645 (2023)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang, T. et al. マウス大腸炎モデルにおけるポストバイオティクスによる腸内マイクロバイオーム調節効果は、プロバイオティクスよりも強い。 NPJ Sci. 食品 6、53 (2022)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイ、T.ら。コウミス微生物叢と有機酸、およびそれらがコウミスの味に及ぼす影響のプロファイリング。 BMC微生物。 20、85 (2020)。

記事 Google Scholar

Settachaimongkon, S. et al. セットヨーグルト中の代謝産物形成に対するプロバイオティクス細菌の選択された株の影響。内部。 Dairy J. 38、1–10 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

サン、Ｙら。スターター培養物およびプロバイオティクスのラクトバチルス・カゼイ・チャンミルクの発酵および保存における異なる重要な時点を識別するための、揮発性代謝物の代謝フットプリント分析。 J. デイリーサイエンス 104、2553–2563 (2021b)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cao、M.ら。代謝操作されたクレブシエラ・オキシトカによるホエイパウダーからのピルビン酸生成。 J. 農業食品化学。 68、15275–15283 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マーフィー国会議員とオニール、LAJ クレブスサイクルが再考されました: 信号変換器としてのコハク酸塩とイタコン酸塩の新たな役割。セル 174、780–784 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ilica, RA、Kloetzer, L.、Galaction, AI および Cascaval, D. フマル酸: 生成と分離。バイオテクノロジー。レット。 41、47–57 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

山本英、渡辺理、遠山英、木村 K. Lactobacillus delbrueckii ssp. の増殖に対するフマル酸の効果。ヨーグルト発酵中のブルガリクス。 J. デイリーサイエンス 104、9617–9626 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ge、Xら。フマル酸塩は PTEN を阻害し、2 型乳頭状腎細胞癌の腫瘍形成と治療抵抗性を促進します。モル。セル 82、1249–1260.e1247 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、Y.ら。ミトコンドリアのピルビン酸キャリアは、心筋ストレスの適応に必要です。ナット。メタブ。 2、1248–1264 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu、L.ら。腸内微生物叢の調節に関わる不眠症に対する GABA が豊富な発酵乳の有益な効果。微生物研究所 233、126409 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

リー、Ｓ．ら。 γ-アミノ酪酸（GABA）生成酵母のプロバイオティクスの可能性とチーズの品質に対するその影響。 J. デイリーサイエンス 104、6559–6576 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Barros-Santos、T. et al. 雄マウスの認知行動、不安行動および抑うつ様行動に対するラクトバチルス・プランタルムの新株による慢性治療の効果。 PLoS ONE 15、e0234037 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フシン、FS 他。新規の自己クローンLactobacillus plantarum Taj-Apis362およびメタボロミクスプロファイリングを使用して発酵したヨーグルト中の単純炭水化物によるGABA強化。科学。議員 11、9417 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin-Bautista、E. et al. エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、オレイン酸、および厳選されたビタミンを強化した牛乳を 1 年間摂取した後の骨形成バイオマーカーの改善。ニュートル。解像度 30、320–326 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q. et al. 食事によるオレイン酸補給と血液炎症マーカー: ランダム化比較試験の系統的レビューとメタ分析。クリティカル。食品科学牧師ニュートル。 62、2508–2525 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Li, D.、Zheng, Y.、Kwok, LY、Zhang, W. & Sun, T. 代謝フットプリンティングにより、サーモフィラス菌を使用した褐色の発酵乳製品における重要な生化学的変化が明らかになりました。 J. デイリーサイエンス 103、2128–2138 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Senyilmaz-Tiebe, D. et al. 食物中のステアリン酸は、ヒトの生体内でミトコンドリアを調節します。ナット。共通。 9、3129 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ボーランド、L.ら。 IFN-ガンマおよびTNF-アルファのプレライセンスは、間葉系間質細胞をパルミチン酸の炎症促進効果から保護します。モル。それで。 26、860–873 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gaeini, Z.、Bahadoran, Z. & Mirmiran, P. 飽和脂肪酸摂取と 2 型糖尿病のリスク: コホート研究の最新の体系的レビューと用量反応メタ分析。上級ニュートル。 13、2125–2135 (2022)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Palomer, X.、Pizarro-Delgado, J.、Barroso, E.、Vazquez-Carrera, M. パルミチン酸とオレイン酸：2 型糖尿病における脂肪酸の陰と陽。内分泌のトレンド。メタブ。 29、178–190 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤン、B.ら。高ステアリン酸食は腸内微生物叢を調節し、急性移植片対宿主病を悪化させます。信号伝達。ターゲットサー。 6、277（2021）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang, CY & Pan, TM ラクトバチルス・パラカゼイ亜種の生物活性化合物の同定パラカゼイ NTU 101 発酵再構成スキムミルク、および 5-フルオロウラシルと組み合わせた結腸直腸癌細胞に対する抗癌効果。食の機能 10、7634–7644 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

セレム、L.ら。個々の食事性 SFA の代替が循環脂質および心臓代謝の健康状態のその他のバイオマーカーに及ぼす影響: ヒトにおけるランダム化比較試験の系統的レビューとメタ分析。上級ニュートル。 13、1200–1225 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

オーガスティン、K.ら。神経障害および代謝障害における中鎖トリグリセリドのケトジェニックダイエット。ランセットニューロール。 17、84–93 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

彼、S.ら。高感度フローサイトメトリーを使用して、プロバイオティクス製品中の生/死んだ乳酸菌を迅速に定量します。メソッドの適用。蛍光。 5、024002 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家自然科学財団（32260572）、内モンゴル科学技術主要プロジェクト（2021ZD0014）、CARS-36専用基金、および内モンゴル自治区自然科学財団の主要プロジェクト（2021ZD0014）によって資金提供されました。 No.2020ZD12）。

Yaru Sun、Shuai Guo といった著者も同様に貢献しました。

酪農バイオテクノロジーおよびエンジニアリングの主要実験室（内モンゴル農業大学）、教育省、010018、フフホト、中国

Yaru Sun、Shuai Guo、Ting Wu、Jingwen Zhang、Lai-Yu Kwok、Zhihong Sun、Heping Zhang & Jicheng Wang

農業農村省乳製品加工重点研究所、010018、フフホト市、中国

Yaru Sun、Shuai Guo、Ting Wu、Jingwen Zhang、Lai-Yu Kwok、Zhihong Sun、Heping Zhang & Jicheng Wang

内モンゴル酪農バイオテクノロジーおよびエンジニアリング主要実験室、内モンゴル農業大学、010018、呼和浩特、中国

Yaru Sun、Shuai Guo、Ting Wu、Jingwen Zhang、Lai-Yu Kwok、Zhihong Sun、Heping Zhang & Jicheng Wang

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

YS: 執筆—原案、調査、検証、視覚化。 SG: 執筆—原案、調査、検証。 TW: 調査です。 JZ: 調査です。 L.-YK: 執筆 - レビューと編集。 ZS: 概念化、調査、執筆 - レビューと編集。 HZ: 概念化、調査、執筆 - レビューと編集。 JW: 概念化、監督、プロジェクト管理。

王吉成氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Sun, Y.、Guo, S.、Wu, T. 他非標的質量分析ベースのメタボロミクスアプローチは、発酵中の複合プロバイオティクス発酵乳の生化学的変化を明らかにします。 npj サイエンスフード 7, 21 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 12 月 9 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供