弱いタンパク質のリガンド結合モードを決定するためのタンパク質のメチルプローブ

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11231 (2022) この記事を引用

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タンパク質とリガンドの複合体の構造は、医薬品設計に重要な情報を提供します。ほとんどのタンパク質とリガンドの複合体の構造は X 線結晶構造解析を使用して決定されますが、結晶構造解析で複合体の構造を生成できない場合には、NMR が最良の代替手段となることがよくあります。しかし、NMR によるタンパク質-リガンド複合体の迅速かつ堅牢な構造決定を可能にする利用可能なツールは現在限られています。これにより、プロジェクトが中止されたり、構造データなしで続行されたりする状況が発生し、タスクがより困難になります。我々は以前、タンパク質共鳴割り当てという面倒な作業を必要とせずに、タンパク質-リガンド複合体の構造を決定できるNMR分子置換（NMR2）アプローチを報告しました。ここでは、選択的に標識されたタンパク質サンプルと未標識リガンドからまばらなタンパク質のメチル対リガンド NOE を収集することにより、弱いタンパク質-リガンド複合体における小分子の結合状態を決定する NMR2 アプローチについて説明します。選択的標識スキームでは、タンパク質のすべてのメチル含有残基が、重水素化されたバックグラウンドでプロトン化されます。これにより、同位体フィルターを使用した NMR 実験の代わりに、標準的な NOESY パルスシーケンスを使用して、より高い感度で分子間 NOE を測定できるようになります。この標識アプローチは NMR2 アプローチによく適しており、その有用性をより大きなタンパク質-リガンド複合体を含めて拡張します。

構造に基づいた薬剤設計は、ヒットからリードへの最適化プロセスにおいて非常に効率的であることが証明されています1。 X 線結晶構造解析は、構造データを生成するための推奨技術です 2。結晶化は一般に、親和性の高いリガンドに対してはうまく機能しますが、結合が弱いリガンドの場合はより困難になる場合があります。複合体が結晶化しない場合、NMR は構造データを生成するための代替アプローチを提供できます。ただし、NMR による構造の生成に必要な時間は、医薬品化学プロジェクトにとっては長すぎることがよくあります。近年、リガンドの結合様式を報告する多数の NMR 法が開発されています 3。化学シフト摂動 (CSP)4、5、6、7、飽和移動 8、部分 NMR 共鳴帰属 9、および擬似接触シフトアプローチ 10、11 は、この問題に対処するいくつかの方法です 12、13、14。我々は以前、NMR分子置換（NMR2）と呼ばれるタンパク質-リガンド結合部位の構造を導出する方法を報告しました。この方法では、タンパク質とリガンドの結合部位の正確な構造を数日以内に生成できます 15、16、17。 NMR2 にはバックボーンもサイドチェーンの割り当ても必要ありません。代わりに、この方法では、結合構造を計算するためのタンパク質の開始モデルと組み合わせて、実験入力として、半曖昧なタンパク質-リガンドの分子間 NOE およびリガンド内 NOE を使用します。構造計算は標準的な NMR プロトコルに基づいており、実験入力と計算された構造の間の一致に従って出力がランク付けされます。 NMR2 は体系的な手法であるため、確率的要素は含まれません。また、ドッキングレシピではなく、一連の堅牢な構造計算プロトコルに依存します。 NMR2 を使用すると、強い結合剤と弱い結合剤、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物が関与するいくつかの異なるタイプの複雑な構造を解くことができます 15、16、17。この方法は、潜在的な結合ポケットを検出することもできます 15、16、17。ここでは、重水素化バックグラウンドでの特定のメチル標識スキームと組み合わせたNMR2の使用について詳しく説明します（補足図S1を参照）。タンパク質 NMR における特定のメチル標識スキームの利点は、メチル基が重水素化されたバックグラウンドでプロトン化されることにより、メチル基の好ましい緩和特性により、はるかに高分子量のシステムを研究できるようになります 18,19。さらに、メチル基の立体特異的標識が可能であるため、タンパク質の共鳴割り当ての曖昧さが軽減されます。

ここでは、タンパク質上の浅い動的部位に結合する柔軟な低親和性リガンドであるフェニルチアゾール 1 を含む挑戦的なシステムで、NMR2 法と選択的メチル標識技術を組み合わせる可能性を例示します。この研究で使用されるモデルタンパク質は、ペリプラズム内の分泌タンパク質におけるジスルフィド結合の形成を触媒する大腸菌由来の 21 kDa DsbA 酵素 (EcDsbA) です。 EcDsbA は細菌の毒性に必須であるため、新しい抗菌薬の開発にとって魅力的な標的となります 20。

我々は、X 線結晶構造解析、NMR2、HADDOCK4 を用いた NMR データ駆動型ドッキング、CYANA を使用した古典的 NMR 構造計算という 4 つの異なるアプローチを使用して、酸化 EcDsbA に結合したリガンドの構造モデルを生成しました。 4 つのアプローチすべてで、フェニルチアゾール 1 の位置に小さな変動はあるものの、同様の結合姿勢が見られました (下記を参照)。 EcDsbA は、次のメチル基のプロトン化で選択的に標識されています: AβIδ1(LV)proRMεTϒ2、一方、残りのプロトンは重水素化されています 21,22。 [U-2H]-AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-CH3 標識 EcDsbA およびフェニルチアゾール 1 からの従来の NOESY 実験では、タンパク質のアミド共鳴とリガンドの芳香族共鳴の間のピークの重複により、アミド領域におけるあいまいな分子間 NOE クロスピークが得られる可能性があります。したがって、NMR実験はD2O NMRバッファーで実行されました（補足図S2およびS3を参照）。すべてのメチル含有残基を標識すると、選択的メチル標識アプローチよりもタンパク質表面をより広範囲にカバーできます 23,24。さらに、現在のスキームにおけるILVメチル基の標識パターンは、これらの残基タイプのそれぞれで1つのメチル基のみが標識されるため、NMRスペクトルの複雑さを軽減し、それによって明確で立体特異的な情報を提供します（図1）。ピークの重なりが減少することに加えて、プロトン密度が低いため、この標識スキームによってスピン拡散も大幅に減少します。スピン拡散は、高い混合時間で NOE クロスピーク強度を支配するため、直接 1H-1H 磁化移動を測定する際の大きな制限となります。直接的な NOE 伝達は意味のある距離に変換できますが、スピン拡散により距離の制約に不確実性が生じます。

研究で使用されたラベル付け戦略。細菌性酸化還元酵素 EcDsbA の構造におけるプロトン密度の概略図。アミド (HN) および総 (HT) プロトンの位置を示します (a) 完全にプロトン化された場合、(b) メチル基を除いて完全に重水素化された場合。全陽子の11%。 (c) メチル基の高速回転により NMR スペクトルの線幅が狭くなることを示す概略図。（ d 、 e ）三重標識サンプルで使用される標識スキーム。Ile、Leu、および Val で 1 つのメチル基のみがプロトン化され、完全にプロトン化されたタンパク質と比較してプロトン密度が 6% に減少します。 (e、f) EcDsbA のリガンド結合部位を形成する残基は黄色で色付けされ、結合部位に隣接するメチル含有残基の位置が強調表示されます。 HT は、酸化 EcDsbA (PDB ID: 1FVK) の NMR スペクトルで予想されるプロトン共鳴の総数を示します。予想されるプロトン共鳴の総数は、メチル/メチレン/対称芳香族プロトンが同じ化学シフトを有すると仮定して計算されました。分析はMOLMOLによって行われました。

タンパク質内の陽子の大部分を重陽子で置換すると、信号対雑音比が向上し、スピン拡散が減少するため、NOE クロスピークに含まれる距離情報の品質が維持されます。 NOE クロスピークを図 2 に示し、補足表 S1 には、0.25 mM EcDsbA および 3.5 mM フェニルチアゾール 1 を含むサンプルで観察された対応する推定 NOE 距離が含まれています。濃度25（補足図S4）。リガンド親和性 (KD) は、リガンド濃度の増加とともに記録された HSQC スペクトルで測定された化学シフトの摂動に基づいて、0.9 mM と推定されました。その結果、実験条件下では EcDsbA の 79% がリガンド結合状態にありました 26 (補足図 S5)。 HADDOCK プロトコルおよび古典的な NMR 構造計算では、タンパク質の割り当ては標準的な NMR 実験を使用して取得されました。

複合体のX線結晶構造は、EcDsbAの結晶をフェニルチアゾール1に浸すことによって決定され、解像度2.0Åまで精製されました（図3;補足表S2を参照）。結晶には非対称ユニットに 2 つのプロトマーが含まれており、図 3 に示すように、鎖 A の疎水性溝に結合しているフェニルチアゾール 1 分子 1 つだけで部分的な電子密度が観察されましたが、分子間で追加の接触が行われています。 NMR2 に由来する構造は、タンパク質の割り当てなしで分子間タンパク質 - リガンド NOE リストを使用して計算されました (補足表 S1 を参照)。

NOESY データは 2 つの混合時間で取得され、NOE 蓄積曲線の初期速度から距離制約を導き出しました。初期の線形挙動を示さなかった NOE 蓄積曲線は分析には使用されませんでした (補足図 S6 を参照)。 2 回の混合時間は、ビルドアップ曲線の初期直線性をチェックするために必要な 3 つのデータポイント (2 つの測定データポイントとゼロ時間ポイント) を提供するため、最小限必要です。正確な距離を抽出するには初期磁化と自己緩和率が必要であるため、対角線のピーク減衰も評価されました27。リガンドは、化学シフトおよび緩和時間スケールと比較して、高速交換における弱い結合剤であるため、分子間 NOE はタンパク質占有率に対して補正されました。この方法で得られた距離は、従来の NOE から導出された距離と比較してより正確ですが、タンパク質の割り当てがないため、半曖昧と呼ばれます 28。それにもかかわらず、この制約は、文献で以前に定義された曖昧な制約とは異なる方法で使用されます29、30。標準的な曖昧な制約により、2 つ以上の共鳴から生じる複数の陽子を同時に使用して 1 つの NOE を満たすことができます。 NMR2 プロトコルでは、これは禁止されており、各 NOE 制約は、2 つの NMR 共鳴に対応する 2 つの陽子のグループに明示的に関連付けられている必要があります。この解析では、古典的なあいまいな制約と比較して、より明確な距離情報が得られますが、重複するピークを含む NOE を NMR2 計算で使用できないことが必要です。ピークの重複の可能性を最小限に抑えるために、高分解能定時間 2D [13C,1H]-HSQC スペクトルが記録されました。私たちの標識スキームと組み合わせると、これは異なる残基タイプを区別し、この場合、3D炭素分解NOESY-HMQCスペクトルで優れた分解能が観察されました（補足図S2および図2）。私たちの標識スキームでは、同位体フィルターを使用した NMR 実験の使用も回避しています。これにより、標準的な NOESY パルスシーケンスの感度が向上するため、信号対雑音比がより優れたスペクトルが得られます。間接NOESY次元における分子間クロスピークの分解能と感度をさらに高めるために、不均一サンプリング取得スキームを使用できます（補足図S7を参照）。構造計算プロトコルではメチル割り当てが必要ないため、タンパク質 - リガンド NOE に加えて、3D 13C 分解 NOESY-HMQC から導出された割り当てられていないタンパク質内メチル - メチル距離も NMR2 で使用できます (補足表を参照) S1)。

酸化型 EcDsbA とフェニルチアゾール 1 の間の分子間 NOE。(a) フェニルチアゾール 1 の化学構造。(b) 3.5 mM フェニルチアゾール 1 を使用した 0.25 mM EcDsbA の 3D 13C 編集 [1H,1H]-NOESY HMQC スペクトルからの [1H,1H] ストリップ400 ms の NOE 混合時間で 298 K で記録されました。

NMR2 計算では、リガンドの結合立体構造は、短い 2D ω1、ω2-13C,15N フィルター処理された [1H,1H]-NOESY スペクトルから導出された tr-NOE を使用して計算されました (データは示されていません)3,31,32,33。。リガンドの上位 20 位の結合立体構造、タンパク質の入力構造 (PDB コード 1FVK)、半曖昧な分子間距離のセット、および割り当てられていないタンパク質のメチル-メチル距離を使用して、NMR2 を使用してフェニルチアゾール 1 の構造を決定しました。 EcDsbAの結合部位にあります。図 4a は、最良および 2 番目に優れた NMR2 モデルを示しています。

NMR2 は、複合体の構造とメチル基の部分的な割り当ての両方を提供します。 NMR2 は実験的な距離制約を最もよく満たす構造を計算するように設計されているため、この方法で生成された割り当てにはエラーが含まれる可能性があります。 2 つのメチル基が互いに近い場合、または 2 つのメチル基がリガンドのプロトンから等距離にある場合、構造に影響を与えることなくメチルの割り当てを交換することが可能です。たとえば、フェニルチアゾール 1 に結合した EcDsbA の構造では、Met153 と Met166 のメチルプロトンはリガンドから同様の距離に位置しています。この場合、それらの割り当てを交換することができます。これは、2 つの NMR2 モデル間のフェニルカルボン酸基の位置の違いを説明している可能性があります (図 4a)。ただし、NMR2 計算で使用された他のメチル共鳴の割り当ては、従来の方法から得られた割り当てと一致していました。 3-フェニルプロピル部分から Leu40δ1、Ile42δ1、Thr168γ2、および Met171ε まで 11 本の高品質 NOE 蓄積曲線が観察され、Met153ε とフェニルチアゾール 1 の 2 番目のフェニル部分の間で 1 つの NOE が観察されました。得られた分子間 1H-1H 距離の比較結晶構造と NOE データからのデータを補足表 S3 に示します。構造計算は、HADDOCK と CYANA という 2 つの古典的な NMR ベースのアプローチを使用して実行され、タンパク質の共鳴割り当てが利用されました。古典的構造の計算は、既知のメチル割り当てを持つ補足表 S1 の NOE 制約を使用して、CYANA で実行されました。古典的なCYANA構造計算からの最低の目標関数（TF）を持つモデルを図4bに示します。 CYANA のフェニルチアゾール 1 の結合モードは、メチル割り当てに 1 つの違いがあるにもかかわらず、最良の NMR2 モデルと類似しています。 2 つの異なる割り当て (M5-Gln59 は補足表 S1 の Met153/M166-Qε-Gln59 に対応する) に含まれる NOE から導出された距離が大きく、2 つを区別できないため、この矛盾は構造的に関連しません。さらに、NOE 由来の距離制約と CSP の両方を使用して、HADDOCK を使用して複合体の構造を計算する際の制約を生成しました (補足表 S3 を参照)。上位 5 つの最低エネルギー HADDOCK モデルのアンサンブルを補足図 S8 に示します。フェニルチアゾール 1 の独特の結合モードは、2 番目に優れた NMR2 モデルと同様のすべての HADDOCK モデルで観察されました。最良の HADDOCK モデル (5 つのモデルの中で最も低い HADDOCK スコアを持つ) を図 4c に示します。

X線結晶構造解析とNMR計算から得られた4つの構造モデルはすべて、酸化EcDsbAの浅い溝上の同じ結合部位へのフェニルチアゾール1の結合を示しています（図4a〜c）。いずれの場合も、3-フェニルプロピル部分は疎水性の溝を定義する2つのα-ヘリックスの間に位置し、Met171の近くにありますが、2番目のフェニル基はタンパク質から離れた方向を向いており、溶媒にさらされやすくなります（図4b）。タンパク質に向かって進みます（図4c）。すべての構造の 3-フェニルプロピル部分は Leu40、Met171、および Ile42 と疎水的に接触しますが、2 番目のフェニル環は Met166 (図 4b) または Met153 (図 4c) のいずれかに向けられます。チアゾール環も結合部位で同様の位置を共有していますが、カルボキシレート基の方向が異なります。 X 線構造、最も優れた NMR2 モデルと CYANA モデルでは、カルボキシレートがタンパク質の方向に配向していますが、2 番目に優れた NMR2 モデルと HADDOCK モデルでは、カルボキシレートが溶媒の方向に配向しています。さらに、カルボン酸基がタンパク質の方向に向いている場合、X 線構造と比較して NMR モデルの結合部位により深く結合します。この不一致は、結晶構造内のフェニルチアゾール 1 では部分的な電子密度しか観察されなかったという事実により、解釈が困難です (図 3)。フェニルチアゾール 1-H15/H19 と Thr168-Qγ2 の間に分子間 NOE が観察されなかったため、カルボキシレートが埋もれ、フェニル環が溶媒の方を向いている結合モードは溶液中では起こりにくいと仮説を立てています（図 4b）。 X 線結晶構造で観察される配向から何が予想されるか (補足表 S3 を参照)。さらに、リガンドと隣接するタンパク質との間にいくつかの結晶接触が観察され、これはNMR構造とX線構造の間の不一致を説明できる可能性があります（図3b）。古典的な NMR モデルは NMR2 構造に似ていますが、共鳴のシーケンス固有の割り当てを取得する必要があるため、複雑な構造のモデルを生成するのにかかる時間は桁違いに長くなります。本質的に、NMR2、古典的な CYANA、HADDOCK、および X 線構造はすべて、EcDsbA35 の基質結合部位であると提案されている同じ位置での結合を報告しています。いずれの場合も、モデルはフェニルチアゾールコアが疎水性溝に沿って同様の配向で結合することを示していますが、構造モデルの最大の違いは溶媒にさらされた基にあります。基本的に、NMR2 は妥当な時間枠でモデルを生成します。このモデルは、フラグメント分子上のベクターを定義するのに十分であり、フラグメントを医薬化学を通じてさらに拡張または最適化できます。 NMR2 はリガンドの低い親和性から生じる課題を克服できないため、必要な感度を得るには比較的高いタンパク質濃度が必要です。それにもかかわらず、適切な量の選択的に標識されたタンパク質サンプルを生成して実験を成功させることができます。

EcDsbA-フェニルチアゾール 1 複合体の X 線構造 (解像度 2.0 Å)。 (a) リガンドは青い棒で示され、タンパク質は灰色の漫画で示されます。結合部位における EcDsbA のいくつかの側鎖残基が棒で示されています。明確にするために、結合部位領域のみを示しています。 (b) 鎖 B の重原子 (サーモンスティックに示されている) とリガンドの間の結晶接触は黒い点線で示されています。 (c) シミュレートされたアニーリングでは、2.5σ で輪郭を描き、黄色のメッシュで表示されたフェニルチアゾール 1 の σA 加重 mFo-DFc 電子密度マップが省略されています。 (d) 1σ で輪郭を描き、青いメッシュで表示されたフェニルチアゾール 1 の σA 強調 2mFo-DFc 電子密度マップ。

NMR2、X 線結晶構造解析、および古典的な NMR 構造計算によって導出された EcDsbA – フェニルチアゾール 1 複合体構造。 (a) それぞれ黄色とマゼンタで描かれた最良と 2 番目に優れた NMR2 モデルのオーバーレイ。 (b) 古典的な CYANA および結晶構造に対する最良の NMR2 モデルの比較。それぞれ黄色、オレンジ色、青色で示されています。 (c) NMR2 の 2 番目に良いポーズと最良の HADDOCK モデルとの比較 (シアンで示されています)。すべてのモデルは PyMOL の結晶構造に合わせてグローバルに調整されました。明確にするために、すべてのモデルの結合部位のみを示しています。

要約すると、重水素化バックグラウンドでタンパク質のすべてのメチル基を選択的に標識すると、大きな複合体を使用した構造ベースの薬剤設計のプロセスで NMR2 を利用するための有用なプローブが得られることを示しました。また、EcDsbA の基質結合部位におけるフェニルチアゾール 1 の結合様式も報告します。我々は、X 線結晶構造解析に適していない医薬化学プロジェクトの将来において、提案されている NMR2 分光法アプローチの幅広い応用を期待しています。

EcDsbA をコードするプラスミド B0013-(5644bb) を保有する大腸菌 BL21 (DE3) 細胞を、培地中の D2O の割合を増加させながら継代培養を繰り返し、続いて二重コロニー選択を行うことにより、まず D2O に適応させました 36。最も強い増殖を示したコロニーをグリセロールストックの調製用に選択し、-80 °C で保存しました。重水素化バックグラウンドで AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-13CH3 の標識パターン (以下、[U-2H]-AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-13CH3 と呼びます) を生成するために、HLAM-Aβ/Iδ1/LVproR、U- 13C、NMR-Bio (http://www.nmr-bio.com/) の Mε/Tγ キットを製造業者の指示に従って使用。この標識スキームでは、アラニン β、イソロイシン δ1、メチオニン ε、およびスレオニン γ のメチル位置が選択的にプロトン化されます。ロイシンおよびバリン残基のメチル基は、プロR位置で立体特異的に標識されています。メチオニンおよびスレオニンのメチルは選択的に 13 C 標識され、側鎖の残りは 12 C になります。図のように、アラニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリン残基が 13 C で標識され、線形スピン系が生成されます (図 1d)。 15 NH4Cl を発現培地に添加して、各アミノ酸部位に 15 N を取り込ませました。スレオニンからグリシンへのスクランブルを抑制するために、非標識グリシンも発現培地に含めました。その結果、[15N,1H]-HSQC ではグリシン骨格のアミド共鳴が弱くなります。メチオニンおよびスレオニン前駆体には 15 N が含まれていなかったので、[15N,1H]-HSQC のメチオニンおよびスレオニン残基の弱いクロスピークはおそらくアミノ基転移効果によるものと考えられます（補足図 3a）。発現前培養物は、1 g/L 15NH4Cl および 2 g/L D-グルコース-13C6-1,2,3,4,5,6,6-d7 を補充した 10 mL M9/D2O 培地から調製し、グリセロールストックを使用し、200 rpmで一定に撹拌しながら37℃で16時間インキュベートしました。 15NH4Clを発現培地に添加して、各アミノ酸部位での15N取り込みの効率を評価した。 1 g/L 15NH4Cl および 2 g/L D-グルコース-13C6-1,2,3,4,5,6,6-d7 を補充した 250 mL の M9/D2O 培地に、5 mL の前発現培養物を接種し、インキュベートしました。 37 °C、200 rpm で一定の撹拌を行います。 2-(D3)-メチル-1,2,3,4-(13C4)-アセトラクテートおよび2,3,3,4,4-(D5)-(13C)-メチル-1-メチオニンのD2O溶液は、誘導の 1 時間前に培養物に添加しました (OD600 ～ 0.6)。誘導の 15 分前に、2-ヒドロキシ-2-[2'-(13C),1'-(D2)]-エチル-3-オキソ-4-(D3)-ブタン酸、U-( １３Ｃ）−２−（Ｄ）−１−アラニン、２，３−（Ｄ２），４−（１３Ｃ）−１−スレオニンおよび重水素化グリシンを添加した。増殖培養物の600 nmでの光学密度が0.8に達したとき、培養物を1 mM IPTGで誘導し、200 rpmで一定に撹拌しながら18℃で16時間インキュベートしました。細胞を3200×g、4℃で20分間回収し、-80℃で保存した。その後、タンパク質は前述のように精製および酸化されました 37。骨格アミドの重陽子からプロトンへの完全な交換を達成するために、タンパク質を 2 M 塩酸グアニジン中で室温で 1 時間部分的にアンフォールディングし、10 倍量の緩衝液 (50 mM HEPES (pH 6.8)、50 mM ＮａＣｌ）。さらに脱塩ステップを行った後のリフォールディング収率は約 70% でした。サンプルの調製に使用した選択的メチル標識前駆体の総コストは約 400 ユーロで、約 1.6 mg のリフォールディングされたタンパク質が得られました。

EcDsbA に結合するフェニルチアゾール 1 の平衡解離定数 (KD) を決定するために、[U-15N] 標識酸化 EcDsbA を 90% H2O および 10% を含む HEPES 緩衝液 (50 mM HEPES (pH 6.8)、50 mM NaCl) 中で調製しました。 D2O。 50 μM タンパク質とさまざまな濃度のフェニルチアゾール 1 を含む一連の NMR サンプル (それぞれ総量 160 μL) を調製し、3 mm 薄壁 NMR チューブに移しました。各サンプルの d6-DMSO 濃度は 2% (v/v) でした。 NOESY 実験の場合、350 μL の 0.25 mM [U-2H]-AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-13CH3 標識酸化 EcDsbA および 3.5 mM 非標識フェニルチアゾール 1 を 50 mM NaPi (pH 6.8)、25 mM NaCl、98% で調製しました。 D2O および 2% d6-DMSO を加え、Shigemi NMR チューブに移しました。報告されている D2O 中の緩衝液の pH は、未補正の測定値です。スペクトルはTopspinを使用して処理しました。個々のスペクトルのピークの割り当ては、CARA によって手動で調整されました。化学シフト摂動 (CSP) は、前述の式を使用して計算されました6。 KD は、リガンド枯渇モデルと前述の式を使用して、GraphPad Prism© で計算されました。

すべての NMR スペクトルは、CryoProbe を備えた Bruker 600 MHz または 800 MHz 分光計で 298 K で収集されました。フェニルチアゾール 1 の存在下で側鎖メチル CSP を追跡するために、フェニルチアゾール 1 を使用した場合と使用しない場合の [U-2H]-AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-13CH3 標識 EcDsbA の定常時間 [13C,1H]-HSQC スペクトルを収集しました。 0.25 mM [U-2H]-AβIδ1(LV)proRMεTϒ2-13CH3 標識 EcDsbA および 3.5 mM フェニルチアゾール 1 の 3D 13Cali 編集 [1H,1H]-NOESY-HMQC (NOE 混合時間 100 ms および 400 ms) 実験は、均一なサンプリング、または指数関数的減衰を伴う確率密度関数から抽出された不均一なサンプルのいずれかによって取得されます。 3D NUS 13C メチル編集 [1H,1H]-NOESY-HMQC を取得するために、間接炭素次元と NOESY 次元の 30 × 512 複素点の 25% がそれぞれ約 27 時間で取得されました。 FID ごとに 16 個のトランジェントが取得され、NOE 混合時間は 400 ms に設定されました。均一にサンプリングされた 3D 13C メチル編集 [1H,1H]-NOESY-HMQC データは、同じ取得パラメータを使用して、ただし 54 時間で FID ごとに 8 つのトランジェントを使用して収集されました。均一にサンプリングされた NOESY データは Topspin によって処理されました。一連の 2D ω1、ω2-13C,15N フィルター処理された [1H,1H]-NOESY スペクトルを 10 ms、20 ms、40 ms、および 70 ms の NOE 混合で収集し、溶液中の生物活性リガンドの立体構造を計算しました。線形にサンプリングされたデータセットは Topspin 3.2 (pl6) を使用して処理され、不均一にサンプリングされたデータセットは Topspin の圧縮センシングまたは hmsIST39 を使用して処理されました。スペクトルは、CARA での分析のために XEASY 形式に変換されました。以前に取得した主鎖および側鎖のメチル割り当てを CARA の入力として使用しましたが、ロイシンおよびバリン残基のプロキラルメチル割り当ては、[U-2H]-AβIδ1(LV) の一定時間 [13C,1H]-HSQC スペクトルから確立されました。 ProRMεTϒ2-13CH3 標識 EcDsbA23。

ここで使用されるメチル特異的同位体標識により、13C メチル共鳴の化学シフトに基づいてアミノ酸残基の種類を割り当てることができます。さらに、標識戦略により、13C-メチル炭素が別の13C原子に直接結合しているかどうかに応じて残基の種類を区別することが可能です（図1）。メチオニンの場合、メチル炭素は硫黄原子に結合し、スレオニンの場合、メチルは 12Cβ 炭素に結合します。これにより、一定時間HSQCスペクトルに異なる位相を持つピークが生じ、負のピークはスレオニンとメチオニンのメチル基共鳴に属し(補足図S2を参照)、正のピークは他のメチル共鳴に対応します。したがって、アミノ酸残基タイプ Met および Thr に対応するメチルピークは、その位相と化学シフトによって直接識別でき、この割り当て情報は NMR2 で使用できます。

D2O NMR 緩衝液 (50 mM NaPi (pH 6.8)、25 mM NaCl、2% d6-DMSO) 中の 4 mM フェニルチアゾール 1 での 2D [1H,1H]-NOESY スペクトルを 298 K で取得しました。NOE 混合時間を設定しました。 800ミリ秒まで。 NOEクロスピークシグナルは対角線ピークとは逆の符号であり、リガンドが4 mMの濃度で可溶性であることを示唆しています（補足図S4を参照）。

D2O NMR バッファー (フェニルチアゾール 1 濃度 4 mM、50 mM NaPi (pH 6.8)、25 mM NaCl、2% d6-DMSO) 中の遊離フェニルチアゾール 1 のプロトン化学シフトは、1D 1H、2D [13C,1H]-HMBC を使用して割り当てられました。および 2D [1H,1H]-NOESY スペクトル。タンパク質結合状態におけるフェニルチアゾール 1 の 1H 化学シフトの割り当ては、1D 1H および 2D ω1、ω2-13C,15N フィルター処理された [1H,1H]-NOESY スペクトルを使用して行われました。

データ駆動型 HADDOCK ドッキング計算は、Mohanty et al.23 によって以前に説明されたプロトコルを使用して実行されました。 HADDOCK 用のフェニルチアゾール 1 のトポロジーおよびパラメーターファイルは、ATB サーバー 40 を使用して作成されました。鎖 A と鎖 B の両方からサンプリングされた 40 個のタンパク質配座異性体 (PDB ID:1FVK) が、HADDOCK の入力として提供されました。リガンドの柔軟性を考慮して、Schrödinger Maestro の ConfGen Advanced パネルを使用して、26 個の個別のリガンド配座異性体のセットを生成しました。 CSP > 0.02 ppm を示し、計算上の溶媒アクセス可能性が 15% を超える残基を、HADDOCK におけるあいまいな分子間距離として使用するために選択しました。 HADDOCK には、タンパク質割り当てを含む NMR2 入力 NOE リストが使用されました。分子間 NOE 距離制約は、記載されているように、距離の下限 (ターゲット距離 (Å) – 1.8 Å) と距離の上限 (ターゲット距離 (Å) + ターゲット距離 (Å) の 15%) とともに CNS 形式で表にまとめられました。 10,000 個のモデルが it0 (剛体ドッキングステージ) で生成され、400 個のモデルが it1 (半柔軟模擬アニーリング) で計算され、その後水精製が行われました。最終的な 400 個の水精製 HADDOCK モデルのうち、距離制約違反が最小限 (< 0.5 Å) でエネルギーが最も低い 10 個の構造が解析用に選択されました。 HADDOCK 計算中に静電気フラグがオンになりました。セグメント「Q164-D172」は、以前に報告されたように、HADDOCK ドッキング全体にわたって完全に柔軟であると定義されました23。

フェニルチアゾール 1 の EcDsbA 結晶への浸漬は、以前に記載されたプロトコルを使用して実行されました 37。 EcDsbA-フェニルチアゾール 1 複合体構造座標は、受託番号 7TTV で PDB に登録されています。

NMR2 メソッドは構造の計算に力場を使用しませんが、HADDOCK および X 線結晶解析ソフトウェアから導出された構造は明示的な水分子を使用して最適化されます。すべてのスペクトルは、Topspin 3.1 (Bruker) で処理されました。スペクトルはccpNMR分析2.341で評価した。距離は、単純な 2 スピンシステムモデル (i、j) を使用し、確立されたプロトコル (補足表 S1 を参照) 3、15、28、42、43 に従って NOE 構築曲線から導出されました。自己緩和率 ρi と初期磁化 ΔMii(0) は、単指数関数的減衰関数 ΔMii(t) = ΔMii(0) exp(–ρit) を使用して抽出されました。欠落している自己緩和率は、実験的に導出されたものの中央値に設定されました。交差緩和率 σij は、タンパク質-リガンド NOE の 2 スピン系近似モデル、ΔMij(t)、式 (1) を使用してフィッティングされました。 (1)44．対応する距離 rij は、式 2 で定義された相互緩和率 σij から導出されます。 (3)、

ここで、μ0 は自由空間の透過率、ħ は換算プランク定数、γH は核の磁気回転比、τc はタンパク質-リガンド複合体の回転相関時間です。 37 の分子間 NOE と 49 のリガンド内 NOE を測定できました。スピン拡散の寄与が大きいビルドアップ曲線を除外すると、補足図S6では、距離制限の量がタンパク質-リガンドの場合は12、リガンドのみの場合は19に減りました。リガンドの結合立体構造はあまり収束していなかったので、NMR2 計算の入力として 20 個の最良のリガンド立体構造を使用しました。次に、NMR2 計算中にリガンドの立体構造が抑制され、タンパク質の側鎖が調整されました。 NMR2 構造は、CYANA 標的関数が最も低い構造です (標的関数 ~ 1.0 Å2)。 NOE データセットから予想されるように、NMR2 の 2 番目に最適な結合モード (ターゲット関数 ~ 1.5 Å2) は、最適構造のリガンドの長軸に沿った鏡像です。これは、配位子の芳香環からの NMR 拘束の対称性によるものです。次に、amberff14sb 力場とリガンドのガスタイガー部分電荷を使用して、キメラで構造を最小化しました (100 の最急降下最小化ステップ)。

現在の研究で生成されたデータセットと分析は、リクエストに応じて入手できます ([email protected] および [email protected] に対応)。

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このプロジェクトの研究支援は、JO への SNF 助成金 310030_192646、MS および BH への NHMRC 助成金 1099151、および MS への ARC 助成金 IC180100021 によって提供されました。この研究はチューリッヒ工科大学、ウィーン大学、モナシュ大学から資金援助を受けました。著者らは、インフラへのアクセスを提供するためにシドニー大学の Bio21 NMR 施設とシドニー分析磁気共鳴施設が使用されていることを認めています。 hmsIST を使用した 3D NUS-NOESY-HMQC スペクトルの処理を支援してくれた Scott Anthony Robson に感謝します。また、特定のメチル標識スキームの実装について貴重な議論をしていただいた NMR-Bio の Rime Kerfah にも感謝します。

Biswaranjan Mohanty と Julien Orts の著者も同様に貢献しました。

医薬品化学、モナシュ薬学研究所、モナシュ大学、381 Royal Parade、Parkville、VIC、3052、オーストラリア

ビスワランジャン・モハンティ、ステファン・ネーブル、ウェサム・S・アルワン、ブラッドリー・C・ドーク、マーティン・L・ウィリアムズ、マーティン・J・スキャンロン

ARC Center for Fragment-Based Design、Monash Institute of Pharmaceutical Sciences、Monash University、381 Royal Parade、Parkville、VIC、3052、オーストラリア

ビスワランジャン・モハンティ、ブラッドリー・C・ドーク、マーティン・J・スキャンロン

シドニー分析コア研究施設、シドニー大学、ニューサウスウェールズ州シドニー、2006 年、オーストラリア

ビスワランジャン・モハンティ

ウィーン大学薬学部、Althanstrasse 14、1090、ウィーン、オーストリア

ジュリアン・オルツ

ラ・トローブ分子科学研究所、ラ・トローブ大学、メルボルン、ビクトリア州、3085、オーストラリア

王格清 & ベゴニアヘラス

先端イメージングセンター、クイーンズランド大学、セントルシア、QLD、4072、オーストラリア

メディ・モブリ

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概念化、MJS、BM、JO。方法論、BM、JO、GW、SN、WSA、BCD、MLW。調査、BM、JO、MJS。執筆 - 原案、JO および BM。ライティング - レビュー、BM、JO、BCD、MJS。編集、著者全員。リソースと資金の獲得、MJS と JO

Julien Orts または Martin J. Scanlon との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Mohanty, B.、Orts, J.、Wang, G. 他。弱いタンパク質-リガンド複合体におけるリガンド結合モードを決定するためのタンパク質内のメチルプローブ。 Sci Rep 12、11231 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13561-y

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