ラッカーゼによるチアゾロピリミジンのジアリル化と抗腫瘍剤としての in vitro 評価

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22326 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

Myceliophthora Thermophila laccase (Novozym) によるカテコールのオルトキノンへの酸化に基づいて、入手可能な出発物質からチアゾロ[3,2-a] ピリミジン-3(2H)-オンの新しい誘導体を合成するための穏やかで効率的な方法が開発されました。 51,003) と、これらの in situ への活性メチレン炭素の 1,4-付加により、中程度から良好な収率 (35 ～ 93%) で中間体が生成されました。生成物の構造は、1H NMR、13C NMR、HMBC、HSQC、DEPT-135、および質量分析技術によって確認されました。これらの新規化合物は、ヒト結腸直腸腺癌および肝臓腺癌細胞株に対する活性な抗腫瘍剤として評価されました。すべての化合物は、HT-29 細胞株に対して、IC50 値 9.8 ～ 35.9 μM の強力な阻害活性を示し、陽性対照のドキソルビシンよりも優れており、ほとんどの化合物が HepG2 細胞株に対して強力な抗がん活性を示しました。

2 つのカテコール (1,2-ジヒドロキシル化ベンゼン環) に共有結合している炭素は、その潜在的な生物学的活性と天然物中に存在するため、常に関心を集めてきました 1,2,3,4。 Curculigo sinensis 植物から単離された Sinenside A および B (図 1) は、アスコルビン酸 5 (IC50 = 45.84 μM) に匹敵する IC50 値の抗酸化活性を示しました。ケベコールは、エイサーサッカラムの樹液からメープルシロップを製造する際に形成され、抗炎症特性を持っていました6。ペリプラネタアメリカーナから単離されたペリプラクタム A (図 1) は、ヒト臍帯静脈内皮細胞 7 (HUVEC) に対して抗増殖作用を示しました。

2 つのカテコールに共有結合した炭素を含む天然物。

これらの足場は、従来、触媒としてパラジウムの存在下でのC-Cカップリング反応に使用されるボロン酸8およびビスマス9置換カテコールによって調製されてきました（図2a）。これらの方法の欠点には、カテコールの事前官能基化の必要性、反応を行うための高温、保護とそれに続くヒドロキシル基の脱保護の義務などが挙げられます。あるいは、これらの構造は、カルボニル基への付加に t-BuLi とブロモカテコールを使用することによるハロゲン - 金属交換によって調製することもできます (図 2b)10。この方法の欠点には、低温 (-78 °C) が必要であること、およびこれらの反応を窒素またはアルゴン雰囲気の存在下で実行する必要があることが含まれます。したがって、穏やかで「グリーン」な反応条件と操作の簡単さでこれらの足場を調製するための代替方法が提案されています（図2c）。

前作も今作も。

近年、マルチ銅オキシダーゼであるラッカーゼ（ベンゼンジオール：O2 オキシドレダクターゼ EC 1.10.3.2.）が、多様な有機化合物の合成や環境関連汚染物質の分解において注目を集めています11。このアプローチでは、酸素が酸化剤として作用し、その結果、水が生成されます。ラッカーゼは、広範囲のフェノール化合物および関連化合物の酸化を触媒します12、13。ラッカーゼの適用範囲は、メディエーターを使用することでさらに拡張できます。ラッカーゼは、テトラヒドロキナゾリン 14 および関連する N-複素環式化合物 15 の芳香族化、アルコールのアルデヒド 16 またはカルボン酸 17 への酸化、およびフェノールのトリフルオロメチル化 18 に使用されています。ラッカーゼは、カテコールまたはハイドロキノンによるそれぞれオルトまたはパラキノンへの酸化、およびその後の -CH 酸 19 または -NH2 20 または -SH21 求核試薬による求核攻撃などのドミノプロセスでも利用されます。これらのワンポット反応により、ヒドロキシル化ベンゾ[b]フランやピリミドベンゾチアゾールなどの興味深い有機化合物が生成されます。

チアゾロピリミジンおよびその誘導体は、抗がん性 22、抗菌性 23、抗炎症性 24 などのさまざまな薬理学的特性を持っています。チアゾロ [3,2-a] ピリミジン-3(2H)-オンは、C-2 に活性メチレン炭素があるため、チオインジゴ様化合物 25、2-ベンジリデン 26、 2-アリールヒドラゾノ27および2-オキシイミノ28誘導体。これまでのところ、gem-ジカテコールを含む新しいチアゾロ[3,2-a]ピリミジン-3(2H)-オン誘導体の調製におけるラッカーゼの応用は報告されていない。カテコールとチアゾロピリミジンが同時に存在するため、これらのハイブリッド化合物は生物学的特性の点で大きな可能性を秘めています。

今回我々は、ラッカーゼ触媒によるカテコールのオルトキノンへの酸化とその後の活性メチレン炭素の求核攻撃によるジェムジカテコール合成の新しい戦略を報告する。まず、モデル反応として 0.50 mmol の 6-アセチル-7-メチル-5-フェニル-2H-チアゾロ[3,2-a] ピリミジン-3(5H)-オン (2a) と 1 mmol のカテコール (3a)市販のラッカーゼ（Novozym 51,003）を使用して、リン酸緩衝液（0.01 M、pH 8）とCH3CN（2:1 v/v）の混合物中で室温で反応させた。反応の進行をTLCで24時間検出した。その後生成物の収率は変化しなかったため、最適な反応時間は 4 時間であることが判明しました。酢酸エチルで後処理し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した後、生成物４ａが適度に良好な収率（６５％）で得られた（表１エントリー２）。表 1 からわかるように、モデル反応は、共溶媒としてアセトニトリルを使用し、クエン酸塩 pH 3.5、リン酸塩 pH 4.5 および 7 などのさまざまな緩衝液系で実行されました。 pH 3.5 および 4.5 での反応では生成物は得られず、pH 7 では 8% の生成物しか得られませんでした。また、エタノールやメタノールなどのさまざまな共溶媒もテストされましたが、生成物は生成されませんでした。したがって、最良の条件は、アセトニトリルを含むリン酸緩衝液 pH 8 でした。ラッカーゼを使用せずに反応をテストした場合 (エントリ 4)、生成物は観察されませんでした。酵素の量も最適化され、基質 0.1 mmol に対して市販の酵素製剤 1 ml を使用したときに最高の収率が得られました。

ラッカーゼ活性はさまざまな pH (4.0 ～ 8.0) で測定されました。最高のラッカーゼ活性は pH 4.0 ～ 5.0 であることがわかりました (図 3)。しかし、これらの pH 値では望ましい反応を行うことはできません。これは、酸性 pH ではオルトキノンを攻撃するために C-2 の活性メチレン炭素が活性化されないことが原因である可能性があります。

ラッカーゼ活性に対する pH の影響。

単離された生成物の正確な特性評価のために、1H NMR、13C NMR、H、H-COSY、HMBC、HSQC、DEPT-135、質量分析などのさまざまな同定方法が使用されました。 4a の DEPT-135 および HSQC スペクトル (裏付け情報) は、2 つのカテコール分子に結合した炭素を表す第 4 級炭素 (δc 66.94 ppm) の存在を示しました。 4a の HMBC スペクトル (裏付け情報) に基づいて、第 4 級炭素 (δc 66.94 ppm) とカテコールプロトンの間の相関関係がよく示されています (図 4)。

4a のカテコール環の第 4 級炭素とプロトン間の相関。

また、4a の H, H-COSY スペクトルにより、次の 3 つのスピン系が存在することが明らかになりました。1 つは HA と重なった δH 6.09 ～ 6.12 (m, 1H) のカテコール環のプロトン間のもの (図 4)、および 2 つの二重線はδH 6.44 (d, J = 2.4 Hz, 1H) およびδH 6.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H)、一方、第 2 のスピン系はδH 6.69 (dd, J = 8.3, 2.5 Hz) で別のカテコール環のプロトン間で発生しました。、１Ｈ）およびδＨ６．７５（ｍ、２Ｈ）。 3 番目のスピン系 δH 7.32 (m, 5H) はフェニル環 B に関連しています。

最適化と特性評価の後、反応範囲を調査し、その結果を表 2 にまとめます。結果は、チアゾロピリミジン系の置換に対する比較的広い許容範囲を示しました。結果は、1,2-ジヒドロピリミジン環にケトン置換基を持つ化合物の収率が、この環のエステル置換基よりも優れていることを示しました。それぞれ、4h (73%) と 4c (82%)、4d (35%) と 4e (79%) でした。。 5 位にフェニル-4-Cl (4 l、痕跡)、フェニル-4-Me (4 m、痕跡)、およびバニリン (4d、痕跡) を含むチアゾロ [3,2-a] ピリミジン-3(2H)-オンのみ35%)、収率が低くなりました。

カテコール側での反応の多様性をさらに調べるために、3-メチルカテコール 3b を使用しました。表 2 に示すように、これにより、カテコール 3a を使用した場合よりも優れた収率で生成物が形成されました (4o (93%) 対 4e (79%) および 4n (83%) 対 4k (68%) を比較)。 3-メチルカテコール 3b を使用した場合、2 つの部位 (図 5 の炭素 2 および 3) に対する求核攻撃から生じる生成物の混合物が観察されることが予想されました。しかし、メタカップリングによる結合定数 (J = 2.4 Hz) によれば、炭素 2 への求核攻撃による生成物が 1 つだけ観察されました。

3-メチルカテコール3bと2e、2kの間のラッカーゼ触媒反応の位置選択性。

以前の研究と制御実験に基づいて、考えられるメカニズムを提案できます。反応はラッカーゼ触媒によるカテコール (3a) の o-ベンゾキノン (5a) への酸化から始まると考えられています (図 6)。続いて活性メチレン炭素の1,4-付加が起こり、中間体(6a)が形成される。 2 番目のカテコールの o-ベンゾキノンへの酸化と中間体 6a の求核攻撃により、最終生成物 4a が生成されます。

提案されたメカニズム。

この方法のいくつかの特徴は、グリーンケミストリーの原則と一致しています29。この反応は、安全な環境と考えられる、溶媒としてリン酸緩衝液、共溶媒としてアセトニトリルを 2:1 の比率で使用して実行されました。また、エネルギー効率の観点から、この反応は室温で行われます。この方法では官能基を保護する必要がないため、誘導体を削減できます。

調製した化合物 (4a-d、4f.-k および 4o) の抗腫瘍効力を評価するために、それらの in vitro 細胞傷害活性を 2 つの異なる癌細胞株 HT-29 (ヒト結腸直腸腺癌) および HepG2 (肝臓腺癌) に対して評価しました。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ３０． HT-29 および HepG2 を、さまざまな濃度の調製した化合物で 48 時間処理しました。ドキソルビシンを陽性対照として使用した(48時間の時点で、HT-29についてはIC50 = 63±2.97μM、HepG2については69±3.71μM)。抗増殖効果データは、細胞増殖を 50% 減少させる化合物の濃度として定義される IC50 値として表示されます。 IC50 値は、少なくとも 3 つの独立した実験から生成されました。

さまざまな合成化合物 (4a-d、4f.-k、および 4o) の細胞毒性効果の IC50 値を表 3 に示します。すべての化合物 4a-d、4f.-k、および 4o は、HT- 29 細胞株。試験した化合物の中で、化合物 4b、4d、4k、および 4o がより強力であることが際立っていました (4b については IC50 = 17.1 ± 2.66 μM、4d については IC50 = 11.5 ± 1.38 μM、4k については IC50 = 11.1 ± 0.83 μM、IC50 = 9.8 ± 1.41 μM (4o))、陽性対照のドキソルビシンよりも有意に優れています。一般に、これらのチアゾロピリミジン誘導体の細胞レベルでの構造活性相関 (SAR) は、化合物 4d、4 k と化合物 4 h を比較すると、1,2-ジヒドロピリミジン環にエステル置換基を有する化合物の方がケトン置換基を有する化合物よりも強力であるように見えることを実証しました。それぞれ4j。

さらに、4c と 4k を除くすべての標的化合物が HepG2 細胞株に対して強力な抗癌活性を示し、陽性対照のドキソルビシンよりも強力であったことは言及する価値があります。 4o が HT-29 と HepG2 の両方で優れた結果を示したことは注目に値します。

要約すると、ラッカーゼによるカテコールの関連 o-キノンへの酸化とチアゾロピリミジン-3(2H)-オンの活性メチレン炭素の求核攻撃を通じて、チアゾロピリミジン-3(2H)-オンの新しい誘導体を合成する簡単で効率的な方法が開発されました。これらの中間体に。反応は室温で行われ、酸化剤として空気中の酸素を使用した。これらの新規化合物は、ヒト結腸直腸腺癌および肝臓腺癌細胞株に対する活性な抗腫瘍剤として評価されました。すべての化合物は、HT-29 細胞株に対して強力な阻害活性を示し、IC50 値は 9.8 ～ 35.9 μM で、陽性対照のドクスロビシンよりも優れており、ほとんどの化合物は HepG2 細胞株に対して強力な抗がん活性を示しました。当社化合物の抗がん作用を解明するには、今後の機構研究が明らかに必要であり、さらなる臨床研究における予測のための改善された基礎を提供します。

すべての試薬は市販されており、さらに精製することなく使用されます。抽出および精製に使用した溶媒は使用前に蒸留しました。ラッカーゼ (Novozym 51,003) は、Novozymes (コペンハーゲン、デンマーク) からの寛大な贈り物でした。反応は、シリカゲル 60 F254 を使用する薄層クロマトグラフィー (TLC) によって監視されました。 1Hおよび13C NMRスペクトルは、溶媒としてDMSO-d6およびアセトン-d6を使用し、Bruker Avance分光計で300(75)、400(100)、および500(125)MHzで記録した。化学シフトは、内部標準としてのTMSに対するδH/C 2.49/39.50 ppm (DMSO-d6)およびδH/C δH/C 2.05/29.85 ppm (アセトン-d6)における溶媒シグナルを参照した。融点は、融点 Thermo Scientific 9100 装置を使用して測定され、補正されていません。質量スペクトルは、電子イオン化 (EI) (20 ～ 70 eV) によって Agilent Technologies (HP) 5975C 質量分析計を使用して記録されました。元素分析は、元素分析システム GmbH VarioEL CHN モードで実行されました。

ラッカーゼ溶液 100 μl をさまざまな pH レベル (4.0 ～ 8.0) の緩衝液 2 ml に加え、25 °C、200 rpm で 24 時間インキュベートしました。サンプルの活性は同じ pH レベルで測定されました。

活性は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で基質（１ｍＭ）としてＡＢＴＳを用いて分光光度法（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ、モデルＵＶ１分光光度計）で測定した。ラッカーゼ活性を測定するために、5μlの酵素溶液を965μlの関連緩衝液および30μlのABTS(1mM)溶液に室温で添加して、酸化反応を開始させた。 420 nm（ε = 36 × 103 M−1 cm−1）での吸光度の変化を 40 秒間（5 秒ごと）記録し、反応速度曲線の最初の直線部分の傾きを計算することによって触媒活性をアッセイしました 31。酵素活性の 1 単位は、1 分あたり 1 μmol の ABTS を酸化するのに必要な酵素の量として定義され、活性は U/g で表されました。

文献手順 32 に従って、DHPM 1a ～ 1i および 1j ～ 1 m を次の方法で調製しました。ベンズアルデヒド誘導体 (5 mmol)、アセチルアセトンまたはアセト酢酸エチル (5 mmol)、チオ尿素 (7.5 mmol)、および NH4Cl (0.8 mmol) の混合物を、撹拌しながら 100 °C で 3 時間加熱しました。冷却後、反応混合物を冷水で洗浄し、残留物をエタノールから再結晶させた。

ＤＨＰＭ１ｆ．〜１ｈは、ベンズアルデヒド誘導体（５ｍｍｏｌ）、ジメドン（５ｍｍｏｌ）、チオ尿素（７．５ｍｍｏｌ）およびエタノール（１５ｍｌ）中のＨ２ＳＯ４数滴の混合物によって調製し、還流下で一晩加熱した。冷却後、反応混合物を冷水に滴下し、沈殿した残渣をエタノールから再結晶させた。

文献の手順 28 に従って、対応する DHPM (1 mmol) とクロロ酢酸エチル (1 ml、90 mmol) の混合物を 110 ～ 115 ℃で 30 分間加熱しました。溶液を冷却し、沈殿物を濾別し、水で洗浄しました。酢酸エチル。調製した塩酸塩をEtOH (10 mL)に溶解し、アンモニアを加えてpH 7.5〜8.0に調整しました。減圧下で溶媒を蒸発させ、続いてクロロホルム溶液から蒸発させて、純粋な化合物２ａ〜ｍを得た。

固体 (茶色)、融点: 179 ～ 181 °C、単離収率 = 92%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 8.12 (m、2H)、7.79 ～ 7.56 (m、2H)、6.13 (s) 、1H)、4.16 (m、2H)、2.43 (s、3H)、2.27 (s、3H)。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 196.3、171.5、149.0、148.1、141.8、135.0、130.8、124.0、123.1、116.3、54.5、33.9、31.6、22.8。

固体 (黄色)、融点: 125 ～ 127 °C、単離収率 = 89%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 7.41 ～ 7.17 (m、5H)、5.85 (s、1H)、4.18 (s) 、2H)、2.52 (d、J = 8.0 Hz、2H)、2.23 (d、J = 16.1 Hz、1H)、2.11 (d、J = 16.2 Hz、1H)、1.02 (s、3H)、0.91 (s 、3H）。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 195.3、171.6、165.6、155.5、140.6、128.9、128.7、127.8、113.5、53.5、50.5、43.8、33.3、32.8、28.8、2 7.5。

磁気撹拌子を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、カテコール３（１ｍｍｏｌ）およびカテコール２（０．５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍＬ）溶液または懸濁液を入れた。リン酸緩衝液（０．１０ｍＭ、ｐＨ８．０、１６ｍＬ）およびミセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼ（ノボザイム５１，００３）（５ｍｌ、２．４７ｇ、５０００Ｕ）を加え、混合物を空気下で撹拌した。チアゾロ[3,2-a]ピリミジンが完全に消費されるまで(4時間)、反応の進行を薄層クロマトグラフィーで検出した。次いで、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。層をデカントし、水相をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。分取薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）（３：１）による精製により、標的化合物４を得た。

調製した化合物 (4a-d、4f.-k および 4o) を検査し、標準的な MTT ベースの比色分析を使用して 2 つの癌細胞株 (ヒト結腸直腸腺癌細胞株 HT-29 および肝臓腺癌細胞株 HepG2) に対する細胞毒性効果を評価しました。アッセイ。これらの細胞は、10% 熱活性化ウシ胎児血清 (FBS) を補充した RPMI 1640 培地で培養されました。処理の前日に、適切な数の細胞を 96 ウェルプレート (Corning、ニューヨーク、米国) の各ウェルに播種し、37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。事前に設定した濃度の試験化合物を各ウェルに添加し、ドキソルビシンを陽性対照として使用しました。各濃度を 3 回繰り返しました。 48 時間の曝露期間後、MTT 試薬 (0.5 mg/mL) をウェルに添加し、37 °C で次の 1 ～ 2 時間インキュベートし、その後培地を DMSO に置き換えて、形成された紫色のホルマザン結晶を溶解しました。各ウェルの吸光度をELISAプレートリーダーにより570nmで測定した。

固体 (薄茶色)、融点: 125 ～ 127 °C (分解)、165 mg、単離収率 = 65%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.28 ～ 8.96 (m、4H)、7.30 (q) 、J = 7.3 Hz、5H)、6.83 ～ 6.60 (m、3H)、6.55 ～ 6.38 (m、2H)、6.09 (d、J = 8.5 Hz、2H)、2.36 (s、3H)、2.26 (s、 3H）。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 197.0、173.1、157.0、150.1、146.1、145.8、145.6、145.5、140.1、130.9、130.1、129.1、129.0、127.8、11 9.6、118.9、117.9、116.2、115.7、115.3 、67.4、55.3、31.1、23.8。 MS (EI、70 eV): m/z = 502 [M+]。アナル。 C27H22N2O6Sの計算値:C 64.53; H 4.41; N 5.57; 実測値：C 64.22; H 4.21; N 4.48。

固体 (茶色)、融点: 230 ～ 232 °C、145 mg、単離収率 = 56%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.17 (s, 4H)、7.14 (s, 4H)、6.70 ( m、3H)、6.55–6.38 (m、2H)、6.12 (m、2H)、2.34 (s、3H)、2.25 (m、6H)。13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 197.1、173.1、 156.9、149.9、146.1、145.8、145.6、145.5、138.4、137.2、130.9、130.2、129.7、127.7、119.5、119.0、117.9、116.2、116.1、11 5.7、115.3、67.4、55.0、31.0、23.7、21.2。 MS (EI、70 eV): m/z = 516 [M+]。アナル。 C28H24N2O6Sの計算値:C 65.10; H 4.68; N 5.42; 実測値：C 65.43; H 4.34; N5.12。

固体 (薄茶色)、融点: 85 ～ 87 °C (分解)、225 mg、単離収率 = 82%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.44 ～ 8.86 (m、4H)、8.16 (d) 、J = 8.0 Hz、1H)、8.05 (s、1H)、7.67 (m、2H)、6.82 ～ 6.59 (m、3H)、6.47 (d、J = 8.3 Hz、1H)、6.36 (d、J = 2.6 Hz、1H)、6.25 ～ 6.12 (m、2H)、2.42 (s、3H)、2.31 (s、3H)。 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 196.7, 173.0, 157.5, 151.6, 148.0, 146.1, 145.9, 145.6, 145.5, 142.1, 134.3, 130.9, 130.4, 129.58, 1 23.9、122.3、119.6、118.9、117.3、116.2 、116.0、115.8、115.3、67.5、54.7、31.6、24.2。 MS (EI、70 eV): m/z = 439 [M+-カテコール]。アナル。 C27H21N3O8Sの計算値:C 59.23; H 3.87; N 7.67; 発見値: C 59.12; H 3.71; N 7.51。

固体 (薄茶色)、融点: 176 ～ 178 °C、102 mg、単離収率 = 35%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.17 (s、5H)、6.69 (m、6H)、6.52 (m、2H)、6.23 (d、J = 8.3 Hz、1H)、5.89 (s、1H)、4.07 (q、J = 7.2 Hz、2H)、3.66 (s、3H)、2.33 (s、3H) 、1.16 (t、J = 7.2 Hz、3H)・13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 173.2、165.4、157.3、151.2、147.7、147.2、146.0、145.9、145.6、145.5、131.8、 130.8、130.3、 119.8、119.5、119.1、116.3、116.1、115.9、115.7、115.3、111.6、109.1、67.4、60.5、55.9、55.1、22.7、14.4。 MS (EI、70 eV): m/z = 551 [M+-Et]、470 [M+-カテコール]。アナル。 C29H26N2O9Sの計算値:C 60.20; H 4.53; N 4.84; 実測値：C 60.32; H 4.18; N 4.79。

固体 (薄茶色)、融点: 103 ～ 105 °C (分解)、228 mg、単離収率 = 79%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.20 (s, 4H)、8.18 (d, J) = 7.9 Hz、1H)、8.05 (s、1H)、7.70 (m、2H)、6.71 (m、3H)、6.49 (d、J = 8.3 Hz、1H)、6.39 (s、1H)、6.24 (d) 、J = 8.4 Hz、1H)、6.12 (s、1H)、4.04 (q、J = 7.2 Hz、2H)、2.39 (s、3H)、1.13 (t、J = 7.2 Hz、3H)。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 172.9、164.9、152.9、147.8、146.1、145.9、145.6、145.5、142.5、134.2、130.9、130.2、129.7、123.9、12 2.4、119.6、119.0、116.2、115.7、115.3 、107.8、67.4、60.7、55.1、23.0、14.2。 MS (EI、70 eV): m/z = 549 [M+-Et]。アナル。 C28H23N3O9Sの計算値:C 58.23; H 4.01; N 7.28; 実測値：C 58.62; H 4.21; N 7.48。

固体 (薄茶色)、融点: 144 ～ 146 °C (分解)、196 mg、単離収率 = 61%、1H NMR (499 MHz、アセトン-d6) δ 8.04 (m, 2H)、7.34 (d, J) = 7.9 Hz、2H)、7.29 (t、J = 7.4 Hz、2H)、7.27 ～ 7.23 (m、1H)、6.90 ～ 6.86 (m、1H)、6.83 (s、2H)、6.63 ～ 6.55 (m、 2H)、6.34 (dd、J = 8.3、2.4 Hz、1H)、6.04 (s、1H)、2.62 ～ 2.49 (m、2H)、2.25 (d、J = 16.2 Hz、1H)、2.15 (d、J) = 16.2 Hz、1H)、1.08 (s、3H)、0.98 (s、3H)、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.12 (s、4H)、7.25 (m、5H)、6.81–6.53 ( m、3H)、6.47 (d、J = 8.6 Hz、2H)、6.15 (d、J = 6.9 Hz、1H)、5.91 (s、1H)、2.29 ～ 2.04 (m、2H)、1.00 (s、3H) )、0.88 (s、3H)。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 195.5、173.1、160.6、156.4、146.1、145.9、145.5、140.4、130.6、129.9、128.8、128.6、127.5、119.6、11 8.9、116.2、115.8、115.3、114.5、67.3 、53.9、50.6、44.5、32.7、29.0、27.3。 MS (EI、70 eV): m/z = 542 [M+]。アナル。 C30H26N2O6S の計算値: C66.41; H 4.83; N 5.16; 実測値：C 66.22; H 4.51; N 5.48。

固体 (茶色)、融点: 164 ～ 166 °C (分解)、151 mg、単離収率 = 52%、1H NMR (499 MHz、アセトン-d6) δ 8.20 (s、1H)、8.13 (m、2H) 、8.00 (s、1H)、7.35 (m、4H)、6.90 ～ 6.79 (m、3H)、6.65 (dd、J = 8.3、1.5 Hz、1H)、6.60 (t、J = 1.9 Hz、1H)、 6.40 (dt、J = 8.4、1.9 Hz、1H)、6.03 (s、1H)、2.63 ～ 2.52 (m、2H)、2.29 ～ 2.17 (m、2H)、1.09 (s、3H)、0.99 (s、 3H）。 1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.20 (s、4H)、7.37 (d、J = 8.0 Hz、2H)、7.27 (d、J = 8.2 Hz、2H)、6.81–6.60 (m、3H) 、6.59 ～ 6.41 (m、2H)、6.20 (d、J = 8.4 Hz、1H)、5.92 (s、1H)、2.33 ～ 2.06 (m、2H)、1.02 (s、3H)、0.89 (s、3H) )・13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 195.5, 173., 160.61, 156.5, 146.1, 146.0, 145.6, 139.3, 133.2, 130.5, 129.7, 129.5, 128.9, 119.7, 118.9、116.2、115.8、115.3、 114.1、67.2、53.5、50.5、44.5、32.7、28.9、27.3。 MS (EI、70 eV): m/z = 576 [M+]。アナル。 C30H25ClN2O6Sの計算値:C 62.44; H 4.37; N 4.85; 発見値: C 62.11; H 4.30; N 4.61。

固体 (淡黄色)、215 mg、単離収率 = 73%、融点: 176 ～ 178 °C、1H NMR (499 MHz、アセトン-d6) δ 8.15 (s, 3H)、8.01 (s, 1H)、7.66 (s、1H)、6.93 ～ 6.88 (m、2H)、6.84 (d、J = 1.4 Hz、2H)、6.80 (dd、J = 8.1、2.0 Hz、1H)、6.75 (d、J = 8.2 Hz、 1H)、6.67 ～ 6.61 (m、2H)、6.39 (dd、J = 8.4、2.4 Hz、1H)、6.00 (s、1H)、3.76 (s、3H)、2.59 (m、1H)、2.57 ～ 2.49 (m、1H)、2.27 (d、J = 16.2 Hz、1H)、2.19 (d、J = 16.2 Hz、1H)、1.09 (s、3H)、1.02 (s、3H)。 1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.17 (s、5H)、6.71 (m、6H)、6.53 (m、2H)、6.22 (d、J = 8.2 Hz、1H)、5.87 (s、1H) 、3.67 (s, 3H)、2.46 (s, 2H)、2.31–2.05 (m, 2H)、1.04 (s, 3H)、0.94 (s, 3H)。13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 195.6 、173.3、160.4、156.2、147.6、147.0、146.1、145.9、145.6、131.5、130.8、130.0、120.0、119.6、118.9、116.2、116.1、115.7、 115.3、114.6、111.7、67.3、56.0、53.4、50.6、44.4 、32.7、29.1、27.2。 MS (EI、70 eV): m/z = 480 [M+-カテコール]。アナル。 C31H28N2O8S の計算値:C 63.25; H 4.79; N 4.76; 実測値：C 63.65; H 4.51; N 4.38。

固体 (薄茶色)、融点: 140 ～ 142 °C、247 mg、単離収率 = 90%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.35 ～ 8.95 (m、4H)、8.19 (d、J = 8.3 Hz、2H)、7.54 (d、J = 8.3 Hz、2H)、6.71 (m、3H)、6.50 (m、1H)、6.37 (s、1H)、6.18 (m、2H)、2.40 (s、 3時間）、2.30（秒、3時間）。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 196.6、172.9、157.4、151.3、147.6、146.9、146.1、145.9、145.6、145.5、130.4、129.6、129.2、124.3、11 9.6、119.0、117.4、116.1、116.0、115.7 、115.4、67.5、54.7、31.5、24.1。 (EI、70 eV): m/z = 439 [M+- カテコール]。アナル。 C28H23N3O9Sの計算値:C 58.23; H 4.01; N 7.28; 実測値：C 58.43; H 4.11; N 7.03。

固体 (淡黄色)、融点: 134 ～ 136 °C (分解)、227 mg、単離収率 = 85%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.26 ～ 9.13 (m、3H)、9.04 (s) 、1H)、7.25–7.15 (分、2H)、6.89 (分、2H)、6.84–6.62 (分、3H)、6.52–6.37 (分、2H)、6.13–6.03 (分、2H)、3.42 (秒) 、3H)、2.35 (s、3H)、2.23 (s、2H)。 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 164.4, 154.6, 150.7, 150.5, 150.2, 136.8, 135.7, 134.0, 124.2, 123.6, 120.8, 120.4, 120.0, 119.1, 72 .0、60.2、59.5、45.4、45.1、44.8 、44.5、44.3、44.0、43.7、35.7、28.4。 MS (EI、70 eV): m/z = 424 [M+-カテコール]。アナル。 C28H24N2O7Sの計算値:C 63.15; H 4.54; N 5.26; 実測値：C 63.05; H 4.24; N5.16。

固体 (薄茶色)、融点: 100 ～ 102 °C (分解)、192 mg、単離収率 = 68%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.52 ～ 8.95 (m、4H)、7.17 (d) 、J = 7.9 Hz、2H)、6.88 (d、J = 7.2 Hz、3H)、6.72 (s、2H)、6.46 (m、2H)、6.15 (d、J = 8.1 Hz、1H)、5.91 (s 、1H)、4.03 (q、J = 7.2 Hz、2H)、3.72 (s、3H)、2.35 (s、3H)、1.13 (t、J = 7.1 Hz、3H)。13C NMR (75 MHz、DMSO- d6) δ 164.3、150.5、150.3、150.1、133.6、123.7、120.4、119.0、113.6、65.2、60.2、45.3、45.0、44.8、44.5、44.2、43.9、43.7、 27.5、19.0。 MS (EI、70 eV): m/z = 454 [M+- カテコール]。アナル。 C29H26N2O8Sの計算値:C 61.91; H 4.66; N 4.98; 実測値：C 61.71; H 4.16; N 4.68。

固体 (淡黄色)、融点: 146 ～ 148 °C (分解)、245 mg、単離収率 = 83%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.19 (s, 4H)、7.19 (d, J) = 8.2 Hz、2H)、6.90 (d、J = 8.3 Hz、2H)、6.64 (s、2H)、6.33 ～ 6.26 (m、1H)、5.90 (s、1H)、5.81 (s、1H)、4.02 (q、J = 7.2 Hz、2H)、3.72 (s、3H)、2.50 (s、3H)、2.09 (s、3H)、1.81 (s、3H)、1.12 (t、J = 7.1 Hz、3H) 。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 177.8、170.0、164.4、162.2、156.5、149.6、148.7、148.4、137.4、135.5、133.8、133.3、129.4、129.0、12 5.9、124.9、118.9、118.6、118.4、113.4 、72.1、65.2、60.2、59.6、45.4、45.1、44.8、44.6、44.3、44.0、43.7、27.5、21.3、21.0、19.0。 (EI、70 eV): m/z = 590 [M+]。アナル。 C31H30N2O8S の計算値: C 63.04; H 5.12; N 4.74; 実測値：C 62.74; H 5.02; N 4.24。

固体 (淡黄色)、融点: 96 ～ 98 °C (分解)、282 mg、単離収率 = 93%、1H NMR (300 MHz、DMSO-d6) δ 9.36 (d, 2H)、8.51 (d, 2H) )、8.19 (d、J = 8.5 Hz、1H)、8.06 (s、1H)、7.71 (m、2H)、6.65 (d、J = 2.5 Hz、1H)、6.59 (d、J = 2.4 Hz、1H) )、6.28 (d、J = 2.4 Hz、1H)、6.12 (s、1H)、5.99 (d、J = 2.4 Hz、1H)、4.03 (d、J = 6.9 Hz、2H)、2.51 (s、3H) )、2.39 (s、3H)、2.09 (s、3H)、1.82 (s、3H)、1.12 (t、J = 7.1 Hz、3H)。 13C NMR (75 MHz、DMSO-d6) δ 196.6、172.9、157.4、151.3、147.6、146.9、146.1、145.9、145.6、145.5、130.4、129.6、129.2、124.3、11 9.6、119.0、117.4、116.1、116.0、115.7 、115.4、67.5、54.7、31.5、24.1。 MS (EI、70 eV): m/z = 369 [M+]。アナル。計算。 C30H27N3O9Sの場合：C 59.50; H 4.49; N 6.94; 実測値：C 59.32; H 4.21; N 6.48。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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著者らは、イラン国立科学財団 (INSF) の資金援助に対する助成番号 97010859 と、この研究のために酵素を提供してくれた Novozymes に感謝の意を表します。

イラン、テヘラン、シャヒード・ベヘシュティ大学GC、化学部有機・無機化学学科

マンスール・シャヘディ、ロジーナ・シャハニ、ゾーレ・ハビビ

ナノバイオテクノロジー研究センター、アビセンナ研究所、ACECR、テヘラン、イラン

マリアム・ユセフィ、アーラシュ・ミナエイ＝テヘラニ、ファテメ・ヤズディ・サマディ

Novozymes A/S、Krogshøjvej 36、Bagsværd、2880、コペンハーゲン、デンマーク

ジェスパー・ブラスク

国立遺伝子工学・バイオテクノロジー研究所 (NIGEB)、テヘラン、イラン、産業環境バイオテクノロジー研究所、バイオプロセス工学部

メディ・モハマディ

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MS (概念化; 調査: ソフトウェア作成 - 原案); RS (概念化、調査、可視化); ZH（責任著者、監修、資金獲得）、 MY (責任著者、監修、執筆、レビュー、編集、プロジェクト管理); JB (データキュレーション、形式分析、検証、執筆 - レビューと編集); AM (MTT アッセイ調査; 執筆 - 原案: サポート); 年度（MTTアッセイ調査：補助）； MM（監修：協力、執筆―原案：協力）；。

ゾーレ・ハビビまたはマリアム・ユセフィへの通信。

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転載と許可

Shahedi、M.、Shahani、R.、Habibi、Z. 他。ラッカーゼによるチアゾロピリミジンのジアリル化と抗腫瘍剤としての in vitro 評価。 Sci Rep 12、22326 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26820-9

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受信日: 2022 年 10 月 3 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2022 年 12 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26820-9

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